近段时间，老王在研究RNA与蛋白相互作用的过程中，发现了一个近两年来颇受关注的实验技术——RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），顾名思义就是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。
RIP实验的目的是分析与目标蛋白结合的RNA，原理则是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化并对结合在复合物上的RNA进行测序或PCR分析。
2016年9月23日，意大利Maria R. Matarazzo教授在Methods in Molecular Biology杂志介绍了RIP实验的经典操作方法【1】（觉得英文原文阅读起来比较麻烦的可以到吉赛生物的circRNA公众号搜“RIP实验方法”，即可获得超详细版中文解读）。文中介绍的RIP实验操作流程如下图所示：
图1 经典RIP实验操作流程（来自【1】）
对于完整的RIP实验流程，老王也画了个中文版简图可以帮助大家更好的理解RIP实验操作。
图2 RIP原理流程图
而RIP实验有哪些应用呢？大家都知道RNA是一种不稳定的生物大分子，绝大多数RNA都需要与特定的RNA结合蛋白形成RNA-蛋白复合物才能稳定存在于细胞中。RNA-蛋白复合物驱动了几乎所有细胞过程的基因表达的转录后调控，包括剪接（splicing）、出核转运（nuclear export）、mRNA稳定性以及蛋白转译过程。因此，对基因调控的了解就有赖于确定这些过程中RNA的结合的变化，RIP技术应运而生，可应用于研究miRNA调节靶点、RNA与RNP（RNA结合蛋白）的互作关系等。
案例1. RIP用于研究circRNA与蛋白互作
图3 circ-Foxo3在细胞周期进程中的作用（来自【2】）
图4 RIP和qPCR检测，揭示了circ-Foxo3与蛋白p21和CDK2的关系（来自【2】）
在本研究中，通过p21和CDK2等多种蛋白抗体的RIP实验验证了circ-Foxo3通过与蛋白p21和CDK2的结合【2】。
案例2. RIP用于研究lncRNA与蛋白互作
图5 lncRNA和编码RNA与EZH2结合能力的比较（来自【3】）
在本研究中，使用EZH2特异性抗体对人胃癌细胞系MKN45和AGS，以及对照细胞系GES-1进行RIP-seq，分析了8256个与EZH2相关的RNAs，包括编码和非编码RNAs，其中MALAT1在MKN45细胞系中高表达。并且发现MALAT1通过和EZH2相互作用，抑制原钙黏蛋白因子10（PCDH10）的表达，从而促进胃癌细胞的侵袭和转移【3】。
案例3. RIP用于研究miRNA与蛋白互作
图6 缺铁性和非缺血性NPCs中isomiRs分析（来自【4】）
在本研究中，利用Ago2 RIP-seq，分析非缺血性和缺血性成年大鼠侧脑室下区（SVZ）的神经祖细胞（NPCs）miRNAs的表达情况【4】。
结果显示，相较于非缺血性NPCs，中风改变了NPCs中Ago2相关的miRNAs表达，缺血性NPCs中的isomiRsreads数增加，其中5’末端添加核苷酸的isomiR-142-5p_L+2R-1显著上调，5’末端缺失核苷酸的isomiR-187-5p_L-2R+3显著下调【4】。
说到RIP，就不得不提一下它的搭档RNA pulldown技术。我们知道，RIP是从蛋白出发研究蛋白RNA相互作用的技术，通过已知蛋白去验证可能有相互作用RNA分子；而RNA pulldown则是从RNA出发研究蛋白与RNA相互作用的技术，通过已知RNA去拉蛋白，推测可能与已知RNA结合的蛋白分子，后续可通过WB验证相互作用。所以RIP和RNA pulldown两种技术可以从正反双向进行验证，能更准确的反映RNA与蛋白的相互作用。
案例：综合利用RNA pulldown和RIP用于研究lncRNA与蛋白相互作用
本研究首先通过RNA Pulldown和后续质谱实验找到了与lncRNA MEG3结合的蛋白PTBP1，然后再通过PTBP1的抗体的RIP实验反向验证了lncRNA MEG3与PTBP1蛋白的结合【5】。
图7 RIP揭示HEK293T细胞中PTBP1蛋白与MEG3 RNA的相互作用（来自【5】）
上图中MEG3和PTBP1是要研究的分子，Hprt1是阴性对照。Input是未经IP的对照，IgG是用来判断非特异性扩增的对照，PART1是阳性对照（已知与MEG3结合的蛋白）【5】。
脑洞：
有意思的是，我们在研究中发现，同一个RNA，无论是microRNA还是lncRNA或者circRNA，他们的靶蛋白很可能不仅仅只有一个，运用RIP实验技术，得到RNA-蛋白复合物，分离复合物中的RNA，经过逆转录或构建cDNA 文库，最后利用基因特异性分析技术（PCR、qRT-PCR）或高通量分析技术（高通量测序、基因芯片），分析复合物中RNA的类型及多少；而分离RNA-蛋白复合物中的蛋白，通过质谱或蛋白组测序等方法，还可以用来研究与目标蛋白结合的RNA的其他互作蛋白（蛋白研究非RIP的初始目的，感兴趣的可以充分发挥想象力，惊和喜随时在等你）。
老王看了市场上现在的各种RIP试剂盒，发现绝大部分都只是提供提取纯化RNA，提取蛋白的很少有涉及，这可能是大家对RIP用抗体特异性比较信任，默认实验拉下来的蛋白就是需要的目的蛋白。但从科研严谨性上来说，不提取蛋白做WB等验证，怎么就敢确认拉下来的是你的目标蛋白呢？
吉赛生物强力推出新款RIP试剂盒，能同时分离提取RNA-蛋白复合物中的RNA和蛋白，高质量的RNA可以用于下游的qRT-PCR、数字PCR以及高通量测序（NGS）等实验；提取的蛋白，可广泛用于PAGE凝胶电泳、Western Blot、ELISA检测、质谱或蛋白组测序等实验，一方面验证了RIP拉下来的目标蛋白，另一方面可以研究与目标蛋白结合的RNA的其他相互作用蛋白，满足大家的脑洞需求。
研发已经成功，即将投产，敬请期待。
参考文献：
1. RIP: RNA Immunoprecipitation. Methods Mol Biol, 2016. 1480: p. 73-86.
2. Foxo3 circular RNA retards cell cycle progression via forming ternary complexes with p21 and CDK2.Nucleic Acids Res. 2016 Apr 07;44(6)
3. MALAT1 long ncRNA promotes gastric cancer metastasis by suppressing PCDH10.Oncotarget. 2016 Mar 15; 7(11): 12693–12703.
4. Identification of miRNomes associated with adult neurogenesis after stroke using Argonaute 2-based RNA sequencing.RNA Biol. 2017; 14(5): 488–499.
5. Long noncoding RNA MEG3 induces cholestatic liver injury by interaction withPTBP1 to facilitate shp mRNA decay.Hepatology 2017 02;65(2)