胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升。据研究，90%的PDAC患者中存在原癌基因KRAS突变，且淋巴结（LN）转移是PDAC中重要的转移途径。基于靶向KRAS等位基因突变的基因治疗可以消退70%的转移性PDAC，表明KRAS在转移性PDAC中具有治疗潜力[1]。因此，研究PDAC中KRAS与LN转移之间的作用机制具有重要意义。
环状RNA（circRNA）是共价闭环的单链RNA，参与调节多种生物过程，如基因转录表达、蛋白质翻译以及与RBP特异性结合，已成为肿瘤发生中的一类重要分子。在膀胱癌的研究中曾有报道circRNA在KRAS突变诱发的癌症中具有调节功能[2]，而关于circRNA与PDAC中KRAS突变诱导的LN转移之间的作用机制却知之甚少。
2023年6月26日，广东省人民医院陈汝福教授团队在Cancer Research（IF=11.2)发表文章Mutant KRAS mediates circARFGEF2 biogenesis to promote lymphatic metastasis of pancreatic ductal adenocarcinoma。作者鉴定了一种新的环状RNA——circARFGEF2，发现其在KRAS等位基因G12D突变的PDAC中表达上调，并与KRAS G12D诱导的PDAC淋巴结转移呈正相关，通过体内外实验也证实这一点。研究其机制发现，选择性剪接因子QKI-5能激活circARFGEF2的生物发生，且介导circARFGEF2的miR-1205海绵作用并促进JAK2的激活，进而使STAT3发生磷酸化，最终激活JAK-STAT信号通路，使KRAS G12D诱导的PDAC发生淋巴结转移。综上，本研究阐明了KRAS G12D突变相关的circRNA生物发生机制，并证实了circARFGEF2在KRAS G12D诱导的淋巴结转移性PDAC中具有关键作用，揭示circARFGEF2可作为KRAS G12D诱导的淋巴结转移性PDAC的潜在治疗靶点。
circARFGEF2的鉴定和生物发生机制
首先，作者通过对PDAC组织和邻近的正常组织（NAT）进行了NGS测序，发现在PDAC组织中有50个circRNA表达上调，其中circARFGF2在KRAS G12D 诱导的PDAC中表达上调最显著。而且，与原发性肿瘤相比，淋巴结转移性PDAC中的circARFGF2具有更高的表达水平，且呈正相关。作者进一步通过RNase R测试等实验证明了circARFGEF2的环状结构具有高度稳定性。通过双色荧光报告法和WB检测结果显示，过表达QKI-5会促进PDAC细胞中circARFGEF2的表达，而敲低QKI-5则减少了circARPGEF2的表达量，表明QKI-5参与了circARFGEF2的生物发生。通过Co-IP和pull-down实验表明，QKI-5募集U2AF35并结合内含子3 1128-1180 nt和内含子6 7672-7740 nt，以调节其前体mRNA剪接而成环。
图1 circARFGEF2的鉴定和生物发生机制
circARFGF2在体内外促进KRAS G12D PDAC淋巴结转移
作者通过细胞功能实验发现，KRAS G12D PDAC细胞中的circARFGEF2下调抑制了淋巴管的形成、增殖和迁移能力，而过表达circARFGEF2则产生与之相反的结果。而且，过表达QKI-5增强了淋巴管的形成和迁移能力，但是同时敲低circARFGEF2的表达水平会抑制QKI-5诱导的淋巴管生成。接着，作者运用IVIS和IHC技术和PET-CT扫描检测胰腺中原位肿瘤的葡萄糖代谢水平发现，过表达QKI-5显着促进癌细胞向胰周淋巴结转移，并增加了原位异种移植PDAC小鼠模型中转移性淋巴结数量，但同时敲低circARFGEF2则逆转了该现象。综上表明，QKI-5介导的circARFGEF2环化在体内外促进了KRAS G12D PDAC的淋巴管生成和转移。
图2 circARFGF2促进KRAS G12D PDAC淋巴结转移
circARFGF2在KRAS G12D PDAC中作为miR-1205的海绵
作者运用FISH、核质分离和qPCR检测发现，circARFGEF2主要定位于KRAS G12D PDAC细胞的细胞质中。接着，作者预测到有4个miRNA与circARFGEF2靶向结合，通过RNA pull-down和FISH共定位验证了miR-1205与之结合作用。体外实验表明，过表达circARFGEF2诱发了HLEC管的形成和迁移，而过表达miR-1205明显逆转了这种结果。综上表明，circARFGEF2在KRAS G12D PDAC细胞中充当miR-1205海绵。
图3 circARFGEF2在KRAS G12D PDAC细胞中的miRNA海绵作用
circARFGEF2激活KRAS G12D PDAC中的JAK2-STAT3途径
作者通过转录组分析，鉴定出JAK-STAT途径是与circARFGEF2相关的最显著富集的途径。此外，在KRAS G12D PDAC细胞中，JAK2与circARFGEF2的表达水平呈正相关，而miR-1205与JAK2的表达水平呈负相关。WB结果显示，过表达circARFGEF2使JAK2表达水平上调，且增强STAT3磷酸化水平，敲低circARFGEF2则出现相反结果。此外，IHC分析和PET-CT扫描结果显示，使用JAK2-STAT3途径抑制剂WP1066能显著逆转circARFGEF2过表达对淋巴管生成和淋巴结转移的促进作用。综上表明，circARFGEF2通过激活JAK2-STAT3途径促进KRAS G12D PDAC中的淋巴管生成和淋巴结转移。
图4 circARFGEF2激活KRAS G12D PDAC中的JAK2-STAT3途径
QKI-5/circARFGEF2/JAK2途径在KRAS G12D PDAC患者中的临床意义
作者在PDAC患者中评估了QKI-5介导的circARFGEF2/miR-1205/JAK2途径的临床意义，结果表明miR-1205与淋巴结转移呈负相关，而circARFGEF2、QKI-5和JAK2在淋巴结转移性KRAS G12D PDAC中显著上调。IHC分析显示，QKI-5和JAK2与KRAS G12D PDAC中的circARFGEF2表达水平呈正相关。相关性分析显示，JAK2与miR-1205表达水平呈负相关，而与QKI-5表达水平呈正相关，并且circARFGEF2和miR-1205的表达水平呈负相关，表明QKI-5介导的circARFGEF2/miR-1205/JAK2轴在KRAS G12D PDAC淋巴结转移中发挥关键作用。从而可知，源自QKI-5依赖性剪接的circARFGEF2海绵吸附miR-1205并激活JAK2-STAT3信号通路，诱导KRAS G12D PDAC淋巴结转移。
图5 QKI-5/circARFGEF2/JAK2途径与KRAS G12D PDAC患者的临床相关性
参考文献：
[1] Huang L, Guo Z, Wang F, et al., KRAS mutation: from undruggable to druggable in cancer. 2.Signal Transduct Target Ther 2021;6:386.
[2] Chen J, Sun Y, Ou Z, et al., Androgen receptor-regulated circFNTA activates KRAS signaling to promote bladder cancer invasion. EMBO Rep 2020;21:e48467.
原文链接：
https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-22-3997
