胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的世界卫生组织 IV 级原发性脑癌，即使采用包括手术、放疗和化疗在内的多模式治疗，也几乎无法治愈。研究表明，相当比例的EGFR扩增的GBM肿瘤有异常的MET表达，而激活的MET信号在继发性GBM中更常见，这表明有必要对MET进行深入研究。最近，越来越多的环状RNA（circRNAs）已被证明在人类癌症中产生未被发现的关键靶点，包括GBM。在内部核糖体进入位点（IRES）或N6-甲基腺苷（m6A）修饰的驱动下，circRNAs可以编码功能肽或蛋白质，在自我更新、侵袭和治疗耐药性方面影响癌症干细胞（CSCs）。
2023年7月25日，研究团队在Nature Communications（IF=16.6)发表文章Circular RNA encoded MET variant promotes glioblastoma tumorigenesis。作者发现环状MET RNA（circMET）编码一个由N6-甲基腺苷（m6A）阅读器YTHDF2促进的404个氨基酸的MET变体（MET404）。circMET的基因消融可抑制小鼠中MET404的表达，并减弱MET信号传导。MET404直接与MET β亚基相互作用，并形成一个组成性激活的MET受体，其活性不需要HGF刺激。MET404高表达预示GBM患者预后不良，提示其临床相关性。文章揭示了circMET编码一种蛋白MET404，并揭示了MET404驱动肿瘤发生的精细调节机制。
中山大学附属第一医院张弩教授、陆军医大学西南医院病理研究所及西南肿瘤中心时雨副教授、北京大学生命科学学院白凡研究员、南京医科大学汪秀星教授为共同通讯作者。中山大学第一附属医院钟键博士、WuXujia、GaoYixin、ChenJunju为共同第一作者。
circMET是m6A修饰的潜在编码的circRNA
许多蛋白质编码的环状RNA是由m6A修饰驱动的。为了发现m6A修饰的环状RNA，作者对10个GBM样本进行了RNA-seq和m6A-seq，结合核糖体RNA数据库（Bowtie220）和参考基因组（HISAT221）分析，确定了剪接位点内独特的锚定位置。然后通过find_circ来识别环状RNA，共鉴定出1425个m6A修饰的环状RNA。另外，发现m6A修饰的环状RNA更可能由单个外显子产生，并且在癌组织中表达更高。KEGG富集分析也表明m6A修饰的环状RNA的源基因在多种RTK通路中富集。
接下来作者为了揭示具有编码潜力的环状RNA，利用RNC-seq和find_circ鉴定了GSCs和对照神经干细胞（NSCs），共鉴定出共鉴定了1605个差异表达的RNC-circRNA。为了进一步缩小GSCs中可翻译的环状RNA，将GSCs进行RIP-seq，与上述m6A-seq和RNC-seq结果进行交叉引用，鉴定出了5个候选的环状RNA，作者考虑到MET在GBM肿瘤发生中的关键作用，所以将重点放在circMET（hsa_circ_0082002）上进行研究。
图1 circMET是经过m6A修饰的潜在编码的circRNA
circMET由m6A阅读器YTHDF2驱动编码MET404蛋白
circMET由hMET基因的第2外显子形成，作者使用连接特异性引物验证了circMET（1214 nt），以及对RNase R消化的抗性。circMET包含一个跨物种保守的ORF，该蛋白在人类和小鼠中编码一个404个氨基酸（a.a.）蛋白。作者通过CRISPR/Cas9系统生成circMET敲除（KO）小鼠，并显著降低了circMET水平。在circMET KO小鼠多个器官中MET404表达显著减少，而MET表达未受影响，表明circMET编码了MET404蛋白。
circMET是一种m6A修饰的、YTHDF2相关的circRNA，YTHDF2是一种有效的GBM高表达的胶质瘤预后标志物。所以作者研究YTHDF2对circMET的翻译是否影响，在GSC细胞中敲除了（KD）YTHDF2，发现YTHDF2 KD不影响circMET的表达，但降低了MET404蛋白水平。此外，通过RIP实验表明，YTHDF2突变体W432A和W486A不能与circMET相互作用，因此没有改变MET404蛋白的表达。研究发现，与MET相比，MET404在一些GSCs和GBM癌组织中表达水平相当甚至更高。GBM样本的免疫组化（IHC）显示，MET404表达与YTHDF2表达存在空间相关性，MET404高表达预示GBM患者总生存率较差。
图2 circMET由m6A阅读器YTHDF2驱动编码MET404蛋白
MET404通过激活MET信号通路促进GBM肿瘤的发生
为了探索MET404的未知功能，作者通过构建过表达或敲低circMET的GSC28细胞的RNA-seq，KEGG富集分析发现MET404参与了多种癌变信号通路。接着作者检测了相关信号通路蛋白表达，发现稳定的circMET KD GSC456和GSC23细胞中，p-MET及其下游p-AKT，p-ERK显著抑制；细胞增殖、有限稀释试验和神经球形成能力试验显示，两种类型的circMET KD GSCs均受到抑制；而在GSC28细胞中，呈现相反的结果。
作者在小鼠上进行了验证，MET404的KD抑制了小鼠脑肿瘤异种移植物的生长并延长了总体生存期。了解到MET404激活的p-AKT可以模拟PTENf/-，作者构建了P53f/f；R26-MET404-flagLSL/+；GFAP-Cre转基因小鼠（MET404 KI小鼠）。大多数MET404 KI小鼠在20周时发生了脑肿瘤，肿瘤表型与GBM非常相似，具有高度激活的MET信号。与对照组小鼠（P53f/f；R26-MET404-flag+/+；GFAP-Cre，MST 48.35周，常死于皮下肿瘤）相比，MET404 KI小鼠的总生存期明显较短（MST 29.25周，均死于中枢神经系统肿瘤）。以上结果表明，MET404通过激活MET信号通路对GBM肿瘤发生至关重要。
图3 MET404通过激活MET信号通路促进GBM肿瘤的发生
图4 在基因小鼠模型中MET404的条件性敲入启动GBM
MET404通过与METβ亚基相互作用来激活MET受体
作者对MET404激活MET信号通路的机制进行研究，发现MET404能被分泌到GSC培养基中，并且纯化后的MET404能激活MET和下游信号传导，这些效应可以通过添加MET404中和抗体来拮抗。在GSC28和GSC387细胞中，MET受体的稳定KD抑制了纯化的MET404诱导的MET的激活和下游信号转导。上述结果表明，MET404通过MET受体发挥作用。
接着作者通过IP-MS实验、分析及Reactome通路分析显示，MET404相互作用蛋白与RTK、MET信号通路高度相关。然后利用STRING数据库，建立蛋白相互作用网络。通过IP和IF验证了GSC23细胞中MET404/MET的相互作用。上述结果表明，MET404是一种与MET相互作用的分泌蛋白。
图5 MET404是一种与MET相互作用的分泌蛋白
为了阐明MET404/MET受体结合位点，作者首先使用ClusPro服务器模拟了由MET404和MET外域形成的复合物，发现MET上的542-650残基（跨越MET39的PSI和IPT1结构域）是介导其与MET404相互作用的关键。由此合成了全长MET受体和构建了几个截断的MET受体结构域，发现MET404与MET受体的PSI+ IPT1结构域相互作用，并且MET404和HGF联合处理对p-MET的活化有协同作用，但MET404比HGF的优先级更高。
紧接着作者发现MET404可以在不需要HGF的情况下独立激活p-MET，而RTK的激活需要在配体结合时发生二聚反应。由此进一步通过HA或标记MET单体，并使用相应的标记抗体进行COIP检测，发现在对照组细胞中观察到不同标记的MET之间的相互作用（表明二聚体），并能通过添加纯化的MET404得到加强。综上所述，HGF和MET404独立激活MET受体，并协同作用以最大限度地传递MET信号。
图6 MET404可独立激活MET受体
靶向MET404和奥纳妥珠单抗抑制GBM进展的协同作用
在GBM临床样本中，作者通过IF观察到明显的MET404和p-MET共定位，并且MET404强度与p-MET水平相关。此外，p-MET水平与GBM中MET404表达的相关性强于与MET受体表达的相关性，即MET404是GBM中p-MET的主要激活因子。而MET-404抗体的剂量依赖性添加逐渐降低了GSC23和GSC456细胞中的p-MET水平，提示在GBM中靶向MET404的临床潜力。MET404抗体和奥纳妥珠单抗的联合使用能够最大限度地抑制了GBM进展和体内MET信号传导，并延长了实验小鼠的总生存期。
图7 靶向MET404和奥纳妥珠单抗抑制GBM进展的协同作用
总结
总的来说，本文确定了GBM中一个由circMET生成的分子靶点MET404。作为一种先前未知的MET配体，MET404组成性地激活MET受体，刺激不依赖于HGF的下游效应因子，并驱动GBM的肿瘤发生。用单克隆抗体靶向MET404增强了抗HGF/MET治疗的疗效，凸显了一种可转化的脑恶性肿瘤关键节点治疗策略。
原文链接：
https:/https://www.nature.com/articles/s41467-023-40212-1