Clin Transl Med丨中山大学第一附属医院泌尿外科团队揭示环状RNA在动物肾细胞癌细胞中的双调控机制

肾细胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）是起源于肾小管上皮的恶性肿瘤，占肾脏恶性肿瘤的 80%～90%。环状RNA(circRNAs)在RCC发生和进展中的调节作用已经被确定，但它们的功能、分子机制和潜在的临床应用仍然知之甚少，所以明确肾细胞癌发病及转移的机制对于疾病监测和治疗策略研发具有重要意义。

环状RNA（circRNAs）属于非编码RNA的一个亚类，通过反向剪切形成^[1]。其中，通过母基因的5’端及3’端连接在一起形成环状结构。早期的研究认为，circRNA是不可编码的^[2]，然而，随着测序技术及生物信息学算法的迭代更新，已经发现了许多具有潜在功能的circRNA^[3]。在肾细胞癌（RCC）中，hsa_circ_0057105具有双重作用调控机制。一方面，它通过激活EMT上皮间质转化促进RCC细胞的转移。另一方面，它也增加了RCC细胞的铁死亡敏感性。这表明在hsa_circ_0057105的调节下，RCC细胞需要在“攻击性”和“氧化敏感性”之间做出选择。

2023年7月26日，中山大学第一附属医院泌尿外科黄勇/Jin Xiaohan/罗俊航团队在Clinical and Translational Medicine（IF=10.6）发表文章【Hsa_circ_0057105 modulates a balance of epithelial-mesenchymal transition and ferroptosis vulnerability in renal cell carcinoma】。结果显示，hsa_circ_0057105具有潜在的致癌作用，可能调节肾细胞癌中上皮-间充质转化的激活。hsa_circ_0057105增强肾癌细胞的迁移和侵袭能力，并通过抑制hsa-miR-577的表达来调节COL1A1和VDAC2的表达，后者可以诱导RCC上皮间质转化及调节铁死亡的敏感性。作者通过动物实验验证了hsa_circ_0057105的体内效应。

一、高通量测序鉴定EMT相关的差异表达circRNA及hsa_circ_0057105表征

作者通过对肾癌细胞及癌旁组织进行RNA-seq分析，鉴定到了212个差异表达的circRNA，在癌细胞及癌旁组织的单样本基因富集分析ssGSEA中发现EMT通路的激活与肾细胞癌有着很大的关联。而EMT途径在癌组织及癌旁组织存在显著差异，且通过差异表达的circRNA与EMT的ssGSEA进行全面的相关性分析发现了hsa_circ_0057105，其与EMT通路的ssGSEA的评分相关性最显著。通过染色体定位/背靠背及线性引物设计/qRT-PCR/Sanger测序/RNase R/FISH定位检测hsa_circ_0057105的成环/特异表达/稳定性/细胞定位。其中，hsa_circ_0057105在四种肾癌细胞系的表达量要显著高于正常细胞系，暗示其可能具有致癌功能。

图1. 高通量测序鉴定上皮-间质转化(EMT)相关circRNA

图2. hsa_circ_0057105在肾细胞癌(RCC)中的表达特征

二、多样本下hsa_circ_0057105的表征

作者收集了130对癌组织及癌旁组织样本，通过qRT-PCR/FISH实验中，发现癌组织呈现弥漫性，hsa_circ_0057105的表达要高于癌旁组织，随着临床期的进度及Fuhrman分级发展，hsa_circ_0057105的表达显著增加，同时hsa_circ_0057105的高表达患者组中的总体生存率及无复发生存率较低。

图3. hsa_circ_0057105是肾细胞癌(RCC)中主效致癌因子

三、hsa_circ_0057105在RCC细胞系中发挥作用及分子海绵机制

作者使用了针对hsa_circ_0057105环化位点的siRNA干扰序列，转染siRNA的RCC细胞具有较低的迁移和侵袭能力；同时，作者评估了EMT通路相关的标记物发现，上皮标记物E-cad上升，间质标记物N-cad和Vimentin下降。过表达hsa_circ_0057105后，增加了RCC细胞的侵袭能力，且EMT通路标记物的表达水平与敲低hsa_circ_0057105相比呈现相反的趋势。

图4. hsa_circ_0057105促进RCC细胞侵袭

同时，作者使用了ENCORI和circular RNA interactome database 数据库预测了26个与hsa_circ_0057105互作的miRNA，其中通过双荧光素酶实验确定了miR-577与hsa_circ_0057105互作最为显著，FISH实验显示它们共定位于细胞质，还通过了两者的特异性探针pulldown实验证实了两者的互作。表型研究表明，转染miR-577 mimic后，RCC细胞的迁移和侵袭能力明显降低。综上表明，miR-577作为hsa_circ_0057105的海绵效应靶点。

图5. hsa_circ_0057105调控RCC细胞的海绵机制

四、RCC细胞系中miR-577分子海绵机制下游探索

作者为了鉴定miR-577调控的基因，使用miR-577抑制剂处理组和对照组进行测序以及GSEA、GO分析发现，其下游调控的靶基因参与EMT通路及线粒体代谢，并从中筛选出处理后表达上调且与患者生存率显著相关的3个靶基因：I型胶原蛋白(collagen type I alpha 1 chain, COL1A1)、电压依赖性阴离子通道成孔蛋白(voltage dependent anion channel 2, VDAC2)、脱氧胞苷酸脱氨酶(deoxycytidylate deaminase ,DCTD)，其中COL1A1及VDAC2的3’UTR区存在特异性的靶标序列，可直接被miR-577所调控，并通过双荧光素酶和pulldown实验证实了它们的互作，进一步证明了COL1A1和VDAC2是miR-577的直接靶点。

图6. hsa_circ_0057105调控miR-557/COL1A1和VDAC2海绵机制

五、RCC细胞系中COL1A1及VDAC2靶基因效应

通过TCGA KIRC数据库的GSEA分析表明COL1A1参与EMT通路，同样COL1A1高表达导致患者总体生存率及无复发生存率较低。相关性分析显示其EMT标记物中E-cad表达较低，N-cad和vimentin表达较高，这与过表达hsa_circ_0057105所激活的EMT通路一致。即COL1A1过表达增强了RCC细胞的迁移和侵袭，RCC细胞变得细长，但不影响细胞增殖。

图7. COL1A1控制RCC细胞上皮-间质转化EMT通路的激活

作者发现miR-577的靶基因VDAC2可以控制细胞质和线粒体之间离子和代谢物的交换，GSEA分析发现RCC细胞VDAC2的高表达与铁死亡升高相关，暗示了VDAC2高表达的RCC细胞容易受到铁死亡诱导的氧化损伤。在对照组下，VDAC2并不会导致细胞发生铁死亡，在添加铁死亡诱导剂Erastin时，其能够抑制VDAC2，并加速铁、丙二醛的积累及GSSG的产生和GSH的降低，但是在COL1A1中并没有观察到类似的现象。也就是说，在这种RCC细胞的铁死亡现象中，VDAC2作为增效剂而不是直接诱导作用。

图8. VDAC2促进RCC细胞对铁死亡诱导剂的敏感性

六、hsa_circ_0057105调控miR-577/COL1A1/VDAC2通路来平衡RCC细胞和生物体内的EMT及铁死亡诱导机制

作者为了进一步探索相关的调控机制，设计了miR-577抑制剂/模拟物在hsa_circ_0057105基因敲低/过表达的肾癌细胞系中进行了回补实验。当敲低/过表达hsa_circ_0057105时会抑制/增强RCC细胞的迁移和侵袭，而再分别添加miR-577抑制剂及模拟物时这种现象又会回补，这一点在WB验证中也观察到类似的现象。

图9. hsa_circ_0057105在RCC细胞中激活EMT并促进铁死亡敏感性

作者通过动物体内实验发现，过表达hsa_circ_0057105且添加铁死亡激活剂Erastin的转化小鼠对铁死亡敏感性增强，抑制癌细胞生长。皮下肿瘤的免疫组织化学染色显示，过表达组中COL1A1、VDAV2和EMT标记物被激活的变化有所增加。在小鼠尾静脉注射实验中，过表达组导致癌细胞转移速率增加及转移病灶，这些发现进一步表明了hsa_circ_0057105对激活EMT通路和诱导铁死亡具有双重作用。

图10. hsa_circ_0057105在小鼠体内激活EMT通路及增强铁死亡诱导剂的敏感性

总结

作者研究发现在肾细胞癌（RCC）中，hsa_circ_0057105具有双重作用调控其发病和转移机制。一方面，它通过激活EMT上皮间质转化促进RCC细胞的转移。另一方面，它也增加了RCC细胞的铁死亡敏感性。这表明在hsa_circ_0057105的调节下，RCC细胞需要在“攻击性”和“氧化敏感性”之间做出选择。该研究为RCC中EMT与铁死亡之间的关系提供了新的见解，并为RCC的监测和治疗提供了潜在的生物标志物。

图11. hsa_circ_0057105在RCC中潜在的分子调控机制

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ctm2.1339

参考文献：

[1] Kristensen LS, Andersen MS, Stagsted LVW, Ebbesen KK,Hansen TB, Kjems J. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nat Rev Genet. 2019;20(11):675-691.

[2] Cocquerelle C, Mascrez B, Hetuin D, Bailleul B. Mis-splicing yields circular RNA molecules. FASEB J. 1993;7(1):155-160.

[3] Salzman J, Chen RE, Olsen MN, Wang PL, Brown PO. Celltype specific features of circular RNA expression. PLoS Genet.2013;9(9):e1003777.