晚发型阿尔茨海默病（Late-onset Alzheimer’s disease,AD）及ADRD是一种复杂的、主要发生于老年人且以进行性认知功能障碍、行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变。目前发现circRNA在神经元、突触组织中表达特异性高[1-3]，与AD的发病机制有着密切的联系，但是仍存在许多关键问题，大脑区域及相关神经元中AD相关因子对circRNA的调节尚不清晰，因此，在该领域进一步解析其分子调节机理有助于我们对AD致病机制的理解。
2023年8月，波士顿大学医学院张晓玲团队在Alzheimers Dement（IF=14.0)发表文章【Identification of circRNAs linked to Alzheimer’s disease and related dementias】。作者确定了48个与AD显著相关的差异circRNA，发现circRNA的差异表达与大脑皮层和海马体的Tau蛋白病及认知能力的丧失相关。同时在大脑中发现三个circRNA：circAPP、circPSEN1及circMAPK9可以独立于其同源的线性信使RNA(mRNA)的变化而受到AD相关神经元应激的调节。
一、高通量测序鉴定与AD相关circRNA筛选与差异分析
作者通过对冷冻人脑海马体组织Illumina NovaSeq测序进行RNA-seq分析，从Synapse网站下载西奈山脑库(MSBB)包括额极（Synapse portal）、颞上回（Superior temporal gyrus）、海马旁回（Parahippocampal gyrus）、颞下回（ Inferior frontal gyrus）大脑皮层的RNA-seq数据，以及从NIAGADS数据库下载成人思维变化海马体RNA-seq数据进行分析，并用CIRCexplorer3-CLEAR来检测及定量circRNA，并从人口统计学、临床严重度及神经病理学信息分析了这210个病例样本的临床特征。通过对这210个病例进行RNA质控后，剔除不合格的质检数据，选取来207个样本进行了下游分析，使用STAR将测序数据比对到人类参考基因组中，并使用CIRCexplorer3识别反向剪接连接并识别circRNA，在大脑BM44区鉴定到4912个circRNA，通过对海马体内的circRNA的GO富集分析显示，在249个差异表达的circRNA中，有75%的与突触定位及传递相关，同时在FDR<0.05的情况下，作者发现了48个circRNA在AD和对照之间差异表达，其中9个在大脑皮层区域特异表达，38个circRNA在海马体内与皮层共表达，同时发现circQKI高表达，其是一种RBP与内含子结合，调节组织/细胞上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT），并且在同时在海马体的数据集中（ACT），circ（MAPK9、RAPGEF5、NDST3）显著下调，circHomer1在皮层的表达更加丰富，在这三个AD相关的数据集中都下调。对这些差异表达的circRNA对应的宿主mRNA进行GO/KEGG分析，发现显著富集于突触、突触后密集区域、突触小泡膜蛋白及轴突与神经元途径相关。
图1. 高通量测序鉴定AD相关circRNA
图2. 海马体和大脑皮层的circRNA筛选与差异分析
二、差异表达circRNA与AD患者脑内海马体和大脑皮层的认知功能障碍相关
作者将AD两个大脑区域circRNA的差异表达模式与临床痴呆分级（Clinical Dementia Rating ,CDR）及神经病理学相关的特征（CERAD神经斑块评分、Braak分期）关联起来，部分差异circRNA在大脑皮层及海马体内的表达具有偏好相关性。同时评估了上述48个差异表达的circRNA与Aβ病理（Aβ pathology）、tau蛋白病（tau pathology）及痴呆临床症状评分的相关性，其中69%的circRNA与上述病理通路相关，对于选定的circRNA，如：circ（RIMS1、KCNN2、PSMB1、ATRNL1、PDE4B和HOMER1）等，他们都与Braak和CDR评分有显著的相关性。
图3. 与不同AD相关病理评分指数的circRNA
三、血管性或路易体病变改变了AD患者circRNA的差异表达模式
作者检测了AD、LBD、和VAD患者的circRNA的表达模式，与对照组相比，只有39个circRNA在三种AD类型中表现出共同的差异表达，且在各级评分指标里，AD-LBD亚型都展示出较大数量的差异circRNA，进一步反映出更严重的神经病理特征或突触病理的相关性。这些结果表明，circRNAs的表达根据神经病理类型而变化，可能反映了潜在分子调控途径的差异。
图4. 不同AD亚型下circRNA数量差异表达关系
四、AD相关GWAS基因/位点的circRNA分析
为了探索与AD通路最密切相关的circRNA，利用已经报道过的AD相关的全基因组关联分析（GWAS）检查了circRNA中的同源基因，其中circ（PICALM、PSEN1）在AD中上调、circAPP在AD中下调。同时相应的线性mRNA水平不会因AD状态而改变，这表明AD相关的circRNA变化独立于AD相关的同源mRNA水平的变化。
图5. AD相关的GWAS分析
五、差异表达的circRNA实时荧光定量分析（qPCR）
作者采用qPCR/Sanger测序等方法验证大脑皮层或海马区的11个显著差异表达circRNA，其中circ（KATNAL2、KCNN2、PSMB1、MAPK9）在大脑皮层及海马体中表达下调；其他circ（RIMS1、RAPGEF5、HOMER1、ATRNL1、PDE4B）虽在皮层样本中显示出差异，但是在海马体中没有显示出相关的差异性，可能是作者的样本起始量较小的原因导致的。同时还鉴定了其他AD相关基因产生的circRNA，在大脑皮层中，circAPP显著下调，同时与帕金森病相关的circSLC8A1也表现出强烈而显著的下调。
图6. 差异表达的circRNA的qPCR分析
六、circRNA的分子海绵功能
作者进一步预测了circRNA的miRNA结合位点，选取了3个与AD相关且与circRNA有丰富共识序列的miRNA，作者假设AD病中circAPP的降低会增加miR-15-5p的表达，进一步抑制靶蛋白的表达，发现在AD样本中，通过qPCR验证有BDNF等4个mRNA表达水平下调。同时，在circSLC8A1低表达中也发现miR-7-5p调控的多个mRNA(GABRA1、G3BP2等)的表达水平显著性降低。相反，circPSEN1的增加会使miR-137的表达下调而增加了NFATC1及EGFR的表达量，进一步表明了这些circRNA具有多个靶基因的调控机制。
图7. circRNA-miRNA-靶基因的互作分子机制
七、tau蛋白处理下circRNA的表达变化
接下来，作者进一步研究了circRNA的变化是否可以在细胞实验中重现，检测了其在神经元前体细胞（neuronal precursors cells, NPCs）的表达，从9月龄PS19-P301S小鼠的大脑中提取寡聚tau蛋白并对NPC细胞进行处理，并且降低了AD相关的circRNA的表达（circAPP、circPDE4B、circRAPGEF5、cirmapk9、circRIMS1和circATRNL1），同时还检测了与circRNA对应的同源mRNA的表达水平，也出现下调的现象。但是，circMAPK9/circAPP/circPSEN1对应的mRNA表达水平为不变/降低/降低，表明这些circRNA对oTau蛋白具有特异性效应。同时circAPP在oTau蛋白处理下表达水平下调，与AD具有相似的表达水平，也观察到了IGF1及SNAP25的表达显著降低，这暗示了和AD患者相似的生物调控通路机制。
图8. oTau处理下的circRNA及mRNA的差异表达
总结
作者研究发现circRNA在AD病理中具有调控作用，与大脑皮层及海马体的Tau蛋白病及认知功能障碍相关，其中circAPP、circPSEN1和circMAPK9独立于其对应mRNA的变化而受到调节，对NPC施加oTau外源处理表现出强烈的反应，进一步推测这些circRNA可以成为研究AD疾病相关的潜在生物标记物。
原文链接：
https://alz-journals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/alz.12960
参考文献：
[1] Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 2013;495:333-338.
[2] Szabo L, Salzman J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nat Rev Genet. 2016;17:679-692.
[3] Piwecka M, Glazar P, Hernandez-Miranda LR, et al. Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function. Science. 2017;357.