线性mRNA疫苗的应用受其不稳定性、低效率和先天免疫原性的限制，而结合内部核糖体进入位点（IRESs）和开放阅读框（ORF）的circRNA疫苗提供了一种改进的RNA疫苗接种方法，具有安全性、稳定性、制造简单性和可扩展性等优势。
2023年9月11日，陆军军医大学（第三军医大学）连继勤教授团队在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=39.3）发表了综述文章“Circular RNA vaccine in disease prevention and treatment”。文章全面描述了circRNA疫苗，总结和讨论了包括设计、合成和纯化的制备方法学研究，强调了circRNA疫苗的递送选择及其在疾病治疗和预防中的潜在应用。
mRNA疫苗作为第一代RNA疫苗，在储存和体内递送方面都非常不稳定，解决这一局限性的策略会大大增加mRNA疫苗的生产成本。因此，需要寻找其他替代方法来充分释放RNA疫苗的潜力，而体外合成circRNA的技术突破使下一代RNA疫苗成为可能。从2022年开始，使用人工circRNAs表达相关抗原以触发适应性免疫反应，在2019年新型冠状病毒肺炎（COVID-19）和难以治疗的黑色素瘤恶性肿瘤中显示出治疗和预防效果。
表1：mRNA疫苗与circRNA疫苗的比较
circRNA疫苗的研究历史
circRNA疫苗的研制可分为三个阶段。
第一阶段
1976年，circRNA首次被发现，其形成机制得到阐明。
第二阶段
1981～2022年，circRNA体外合成技术的发展；
1982年，酶连接法；1992年，PIE系统；1993年，化学连接；1994年，外源序列环化；1995年，引入IRES以工程化翻译circRNA；1998年，通过PIE系统工程化翻译circRNA；2011年，HPLC法纯化circRNA；2016年，各种IRES候选物的鉴定；2018年，PIE系统的高效优化；2019年，降低人工circRNA免疫原性；2022年，circRNA高效翻译。
第三阶段
2022年～至今，首次将工程化circRNA疫苗用于COVID-19和黑色素瘤的治疗和预防中，未来将继续推动相关研究和技术发展。
图1：circRNA疫苗的发现和进展
circRNA疫苗的制备
circRNA疫苗的制备主要包括circRNA的设计、合成、纯化、circRNA包封、药效学、安全性评价、制造和临床试验。
根据目标抗原设计肽/蛋白的编码序列，并将其克隆到质粒DNA结构中。质粒DNA通过体外转录（IVT）技术转录成线性RNA前体（pre-circRNA）。接着，pre-circRNA在体外被环化为circRNA。circRNA通过高效液相色谱（HPLC）进一步纯化以去除污染物和反应物。之后，纯化的circRNA被封装在各种载体中。在临床试验之前，应进行药效学和生物安全性评估。最后，通过临床试验进行circRNA疫苗的规模化生产。在引发抗原特异性免疫反应方面，circRNA疫苗主要遵循细胞内过程的三个方面，包括内体逃逸、抗原编码和免疫启动。
简而言之，在抗原呈递细胞（APCs）中，
（1）含有circRNA疫苗的LNPs在细胞质中形成内体；
（2）内体释放circRNA疫苗（内体逃逸）；
（3）circRNA中的编码序列通过核糖体翻译成抗原性蛋白/肽；
（4）内源性抗原被蛋白酶体降解成多肽，并通过MHC I进行呈递；
（5）激活细胞毒性T细胞（CD8+ T细胞），除了细胞免疫外，circRNA诱导的体液免疫对疾病预防也很重要；
（6）APCs中的内源性抗原可被分泌并由MHC II类蛋白呈递给辅助性T细胞，辅助性T细胞（CD4+ T细胞）刺激B细胞产生中和抗体。
图2：建立circRNA疫苗生产流程和利用针对特定疾病的靶抗原策略来引发免疫反应的circRNA疫苗。
circRNA疫苗的潜在应用
circRNA疫苗在COVID-19和黑色素瘤的治疗和预防中取得了令人鼓舞的结果。但circRNA疫苗的应用研究还处于早期阶段。作为下一代RNA技术，工程化circRNA与mRNA疫苗共享相同的ORF依赖性抗原表达技术。由于更高的稳定性、更低的免疫原性和更出色的抗原编码能力，circRNA可以重新设计并取代mRNA疫苗骨架以获得更好的治疗或预防效果。因此，circRNA疫苗在其他病毒感染、其他肿瘤、自身免疫性疾病、代谢性疾病、心血管疾病和囊性纤维化等疾病中具有有前途的应用前景。
图3：circRNA疫苗的潜在应用
总结与展望
根据目前的研究结果，有一些建议可以作为未来研究的方向：
1、核苷酸修饰可能协同增强circRNA疫苗的稳定性并降低免疫原性；
2、环化方法有待进一步研究；
3、迫切需要新的纯化方法来获得高纯度的circRNA。
总之，迫切需要开发和改进体外人工circRNA疫苗的设计、合成、纯化、递送和治疗应用的先进方法。今后的研究应着重于方法的发展、改进、应用和临床试验。通过实现circRNA疫苗的完整性，基于circRNA的新技术将为疾病治疗和预防开辟新的方向。我们期待circRNA疫苗的成功临床转化。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41392-023-01561-x