环状RNA（circRNA）由一种非经典剪接方式——反向剪接产生，反向剪接位点（BSJ）连接首尾两端成环，与其对应的线性mRNA区分开来。在免疫信号传导、炎症反应和病毒感染期间，circRNA表达模式会发生改变，但其在免疫功能和病毒感染中的调节作用却鲜为人知。目前，circRNA在HIV-1复制中的分子作用机制仍然是一大未解之谜。
牛津纳米孔技术（ONT）测序平台可以实现直接RNA测序（DRS），但目前仅用于捕获聚腺苷酸化转录本。因此，长读长测序技术仅应用于来自逆转录产物的circRNA，而逆转过程的反向剪接和外显子重复会给circRNA表达分析带来复杂性[1]。在病毒感染的背景下，病毒转录本的丰度、融合转录本的产生以及RNA代谢的整体失调可能会掩盖由宿主编码的且丰度较低的RNA，使这类RNA的作用和意义被忽视。所以，探索检测病毒感染期间低丰度RNA（例如circRNA）的新方法十分有必要，为研究病毒感染机制提供新思路。
2023年9月6日，印度科学教育研究所（IISER）生物科学系分子病毒学实验室Ajit Chande博士在Science Advances(IF=13.6)发表文章“HIV-1 Vpr induces ciTRAN to prevent transcriptional repression of the provirus”。作者使用Nanopore测序平台实现DRS，从HIV-1感染的T细胞中捕获circRNA并鉴定了一种调节HIV-1转录的circRNA——ciTRAN。研究发现，HIV-1感染会诱导ciTRAN以Vpr依赖方式进行表达，且ciTRAN与SRSF1相互作用。HIV-1通过ciTRAN从病毒转录复合物中剔除SRSF1，从而促进病毒的有效转录。综上表明，宿主circRNA表达对HIV-1复制的影响是灵长类慢病毒克服传播瓶颈的潜在因素。
直接RNA纳米孔测序检测病毒感染诱导的circRNA
首先，作者通过迭代耗尽线性RNA来去除非circRNA，以富集circRNA至50-86倍，再将poly-A尾巴添加到富集的circRNA中，从而实现DRS。纳米孔DRS不仅能获得circRNA的全长序列，还可以同时检测m6A修饰，以此预测除了IRES外的蛋白质编码circRNA。此外，作者将circDR-seq与CIRI-long和circNICK-LRS进行了比较，证明circDR-seq检测到的circRNA数量相当可观，以天然形式检测到1017个circRNA（其中对照组有831个，病毒感染组有186个），并且还评估了其同时捕获RNA修饰和具备编码潜力的可能性。
图1 纳米孔DRS解析病毒感染诱导的circRNA
ciTRAN缓解病毒基因表达的整合后阻滞，影响病毒感染性
作者筛选出10种在感染细胞中的表达上调的circRNA，并运用CRISPR-CasRx技术在T细胞中对其进行敲除。实验发现，敲除ciRAN（circSMARCA5）后的细胞在感染HIV-1时其病毒编码的荧光素酶的表达量明显下降，而同源的线性RNA及其蛋白水平在该条件下不受影响。接着，作者从感染细胞中收集亚细胞组分来确定ciTRAN靶向的病毒生命周期阶段，发现敲降ciTRAN对逆转录的HIV cDNA的数量没有变化，整合的前病毒数量也没有变化，而细胞质中病毒mRNA表达水平减少，导致细胞内病毒Gag积累减少。以上表明，ciTRAN耗竭会抑制病毒感染性，对病毒基因表达并整合到宿主基因组的过程有影响。
图2 ciTRAN靶向病毒基因表达及整合到宿主基因组的过程
ciTRAN与HIV转录的负调节因子结合
作者运用CARPID和质谱技术，发现SRSF1是ciTRAN的最佳互作分子；通过PAR-CLIP检测与SRSF1互作的circRNA，发现ciTRAN的富集倍数最高，表明ciTRAN可能通过与宿主蛋白SRSF1的相互作用来调节HIV-1转录。接着，评估SRSF1对JTAg靶细胞HIV-1感染性的影响发现，SRSF1异位表达引起的表型和敲除ciTRAN的作用效果一致。通过GFP荧光蛋白测定病毒对细胞感染性，发现SRSF1表达减少会使子代病毒粒子的数量也相应地减少，表明SRSF1在病毒生物发生和随后的子代病毒粒子感染性期间存在影响。综上说明，ciTRAN与HIV-1感染性的负调节因子SRSF1具有相互作用。
图3 ciTRAN与HIV-1转录的负调节因子相互作用
ciTRAN通过阻断SRSF1以促进病毒感染性
作者进行了染色质免疫沉淀（ChIP）实验，发现敲降ciTRAN增强了SRSF1与TAR位点的相互作用，这种互作可以将Pol-II从病毒启动子中剔除，表明ciTRAN通过阻断SRSF1来促进病毒启动子的主动转录。接着，作者运用PAR-CLIP技术评估多个SRSF1片段缺失突变体与ciTRAN的相互作用，发现当SRSF2的RRM1区域被删除时，ciTRAN不再有任何富集，而且ciTRAN和ΔRRM2突变体之间丧失相互作用，病毒感染性增加。
作者通过细胞穿膜肽（CPP）融合的RRM2-HA检测特定SRSF1蛋白结构域的作用，证明了SRSF1-RRM2与TAR基因座和ciTRAN的结合作用，并因此抑制病毒复制，而SRSF1-RRM1无该作用。综上表明，SRSF1的RRM2区域识别ciTRAN并与之互作，以抑制病毒复制。
图4 ciTRAN通过阻断SRSF1来促进HIV-1转录
HIV-1 Vpr诱导ciTRAN表达
作者使用RT-qPCR对健康供体和艾滋病毒感染者的全血检测ciTRAN水平，发现自然感染的平均ciTRAN诱导率为5.6倍，而病毒诱导ciTRAN的表达水平高达10倍。而且，只有HIV-1病毒能诱导ciTRAN上调，小鼠白血病病毒MLV则诱导无效。通过RT-qPCR检测缺乏特定病毒基因对ciTRAN表达水平的影响，发现ciTRAN水平在病毒缺乏Vpr时明显降低，而在其他条件下几乎没有变化；在原代CD4细胞中重复该实验，进一步证实了病毒编码的Vpr蛋白对ciTRAN的表达具有诱导作用。
图5 HIV-1 Vpr诱导ciTRAN表达
Vpr对ciTRAN的诱导作用具有保守性
作者分别转染了NL4-3、CH040和REJO病毒中编码代表性Vpr等位基因的pCDNA后，发现均能显著诱导ciTRAN表达，而来自HIV-2的Vpx却不能诱导ciTRAN表达。此外，Vpr诱导ciTRAN有助于增强感染性，还可以增强巨噬细胞中的病毒复制。病毒粒子包装的Vpr也可以诱导ciTRAN表达，且呈剂量依赖性。这些结果表明，HIV-1 Vpr是诱导ciTRAN表达所必需的。
图6 HIV-1 Vpr在诱导ciTRAN表达中具有保守性
Ajit Chande博士
“我们的研究结果表明，HIV-1病毒劫持了这种宿主编码的ciTRAN，使其能够有效地繁殖。这一发现揭示了HIV-1等病毒如何克服传播障碍的未知方面。”
IISER Bhopal主任Gobardhan Das教授
“这项工作开辟了新的研究领域，可能为宿主导向治疗提供新的线索。”
这项研究的另一个重要结果是，研究人员开发了一种小分子蛋白，可以在病毒诱导的ciTRAN中抑制病毒转录。通过展示ciTRAN如何促进病毒有效繁殖的能力，这项研究为开发新的治疗干预措施提供了有希望的途径。此外，能够抑制病毒转录的分子的产生，代表了我们对抗HIV-1和潜在的其他病毒的理解的重大飞跃。
小结：
本文为我们提供了一种纳米孔测序检测环状RNA的新策略，使用特定算法实现对长测序片段中的circRNA序列进行识别和全长重构，进而解析circRNA的功能作用。更多策略可以参考之前的文章：环状RNA十周年丨测序技术篇
原文链接：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adh9170
参考文献：
[1] J. Zhang, L. Hou, Z. Zuo, et al., Comprehensive profiling of circular RNAs with nanopore sequencing and CIRI-long. Nat. Biotechnol. 39, 836–845 (2021).