体外转录（IVT）mRNA在肿瘤免疫和靶向的治疗效果已闻名遐迩。随着纳米递送技术的进步，可以克服治疗性mRNA传递到真核细胞的障碍，COVID-19 IVT mRNA疫苗的大规模临床应用已成为经典案例。
真核生物mRNA翻译主要是甲基鸟苷（m7G）“帽”依赖翻译起始的。而有一种翻译是利用内部核糖体进入位点（IRES）的顺式调节元件来启动翻译，如脊髓灰质炎病毒（PV）等等。
mRNA编码凋亡相关的毒性分子来产生治疗性溶瘤蛋白，如半胱天冬酶、PUMA和MLKL等等。研究发现，溶瘤蛋白具有形成孔的能力，导致膜细胞溶解并引发炎症焦亡，其中以气体D（GSDMD）效果最佳。GSDMDNT作为一种溶解肿瘤细胞的内源性分子，具有独特的优势：
(1)分子量小（31 kDa）和蛋白质构象简单，便于工程修饰和传递；
(2)具有严格的自抑制机制（但一旦激活，GSDMD具有较强的膜裂解能力）；
(3) GSDMD具有胞膜内靶向的特异性，即GSDMDNT破裂后不能破坏邻近细胞，从而控制细胞毒性[1]。
如何将新一代技术融合用于解决癌症问题，需要更多人参与。
2023年10月16日，新加坡A*STAR及国立大学陈小元/东南大学及南京医科大学夏洪平/皖南医学院江晓春团队在Nature Cancer(IF=22.7)发表文章“An in vitro-transcribed circular RNA targets the mitochondrial inner membrane cardiolipin to ablate EIF4G2+/PTBP1+ pan-adenocarcinoma”。
本研究利用内含子-外显子（PIE）剪接环化策略和脂质纳米颗粒（LNP）包装方法（二者能降低mRNA的免疫原性），将人鼻病毒2型（HRV2）内部核糖体进入位点(IRESs，可触发序列在癌细胞 (EIF4G2 和 PTBP1高表达）中翻译)，hGSDMDc .825 T>A/c.884 A>G-F1LCT突变mRNA序列（具备线粒体内膜心磷脂靶向毒性，触发线粒体吞噬，溶解并杀伤肿瘤细胞），组装成GSDMDENG环状RNA。体内实验结果显示，GSDMDENG环状RNA可抑制EIF4G2+ /PTBP1+泛腺癌的发展。并且，非常值得关注的是，在KRASG12D突变引起EIF4G2和PTBP1异常的肿瘤模型中，GSDMDENG环状RNA可显著抑制胰腺、肺和结肠腺癌的发生，提高了生存率，诱导了KRASG12D肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞反应。
GSDMDNT IVT mRNA引发心磷脂膜毒性
eIF4G2和PTBP1高表达于肿瘤组织中，其活跃表达可帮助IRES驱动IVT mRNA的表达，以实现肿瘤的基因靶向（图1a，b）。为了鉴定可驱动表达的IRES，作者构建了四种病毒（HRV2、EMCV、PV_type1_Mahoney和PV_type3_Leon）的IRES双反子IVT-mRNA报告系统。最终结果显示，来自HRV2的IRES在eIF4G2+/PTBP1+肿瘤细胞中表现出选择性表达，此IRES选作后续实验（图1d）。
GSDMD的N端可插入内膜，以肌醇和心磷脂为目标，形成孔，从而破裂质膜。为了选择性地诱发癌细胞的膜毒性，作者组装由HRV2 IRES驱动的GSDMDNT IVT mRNA（图1e）。为了消除真核细胞内内源性GSDMD表达和其他IFs/ITAFs的干扰，作者构建了原核细胞表达和纯化系统。通过电转染将GSDMDNT IVT mRNA和过表达质粒pAOX1-EIF4G2和pHT43-PTBP1导入富含心磷脂的枯草芽孢杆菌中。结果显示，eIF4G2+/PTBP1+肿瘤细胞中，HRV2 IRES可以驱动原核细胞中GSDMDNT mRNA的表达，诱导心磷脂膜毒性（图1f-i）。
图1 GSDMDNT IVT mRNA构建方案以及对心磷脂膜毒性
LNPs将GSDMDNT IVT mRNA传递到eIF4G2+/PTBP1+癌细胞
使用微流控芯片装置，按照DLin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇和peg-脂质的标准脂质配方将HRV2 IRES-GSDMDNT mRNA-LNPs封装在LNPs中（平均直径为100nm），随后递送到eIF4G2+/PTBP1+癌细胞系，以诱导GSDMD依赖性的焦亡（图2a-d）。
与m7G的GSDMDNT mRNA相比，HRV2 IRES-GSDMDNT mRNA-LNPs可以有效地、有选择性地转化为GSDMDNT，并且HRV2 IRES-GSDMDNT mRNA-LNPs不足以引发癌细胞毒性，安全性良好（图2e-f）。这可能与ESCRT机制有关，该机制通过质膜修复机制逃避细胞死亡。
为了验证这一假设，递送后，作者观察到了ESCRT-III招募受损癌细胞膜上的CHMP4A和TSG101，这提示转染GSDMDNT mRNA-LNPs启动了ESCRT修复和死亡逃逸（图2h）。作者构建了CHMP4A−/−的癌细胞模型（可消除ESCRT的修复)。但是，较低剂量（-10 ng）的IRES-GSDMDNT mRNA-LNPs即可启动CHMP4A−/−癌细胞的细胞毒性。因此，需要进一步的修饰，以使其适应与ESCRT机制相关的癌细胞死亡逃逸。
图2 LNPs封装HRV2 IRES-GSDMDNT IVT mRNA，用于真核细胞传递
线粒体传递以逃避ESCRT介导的死亡
真核细胞的mIM是唯一富含心磷脂的亚细胞细胞器，在mIM中尚未观察到有效的ESCRT修复机制。作者欲将GSDMDNT靶向于线粒体心磷脂，通过线粒体损伤触发细胞死亡。
作者设计三个N端线粒体靶向序列（N/MTSs）来靶向线粒体基质（mM）、mIM和线粒体膜间空间（mIS）。结果显示，mM/MTS和mIS/MTS修饰可使GSDMDNT能够导入线粒体。不过，N/MTS-GSDMDNT并没有表现出心磷脂膜毒性。但是，作者在293T细胞中发现，N/MTS肽与含有L192氨基酸位点的GSDMDNT-α4多肽段有特异性结合。因此，作者猜测N/MTS干扰了GSDMDNT在膜插入和孔形成活性位点（L192/E15）期间的蛋白构象。为了保证GSDMDNT的构象活性，作者决定修改方案为修饰其C端信号肽。
牛痘病毒F1L蛋白的C端包含一个疏水结构域，其两侧是带正电荷的残基（28个氨基酸），有助于将牛痘病毒蛋白靶向到线粒体上。F1LCT肽不与GSDMDNT的活性中心结合。然而，GSDMDNT与F1L的C端连接（GSDMDNT-F1LCT）却能保留GSDMDNT心磷脂膜毒性（图3a-e）。经过设计，最终，在LNP中包裹HRV2 IRES-GSDMDNT-F1LCT mRNA，既能启动GSDMDNT的表达，又能促进其转位到线粒体（图3g）。在转染GSDMDNT-F1LCT mRNA-LNPs的AsPC-1癌细胞中，共聚焦显微镜显示GSDMDNT的线粒体形态和定位。相比之下，在非癌细胞中，线粒体中GSDMDNT的荧光强度较低，线粒体的完整性未受到明显影响，提示HRV2 IRES-GSDMDNT-F1LCT mRNA对线粒体的破坏作用（图3g）。
流式细胞检测线粒体碎片发现GSDMDNT-F1LCT mRNA-LNPs处理后，体积更小（<1μm）（图3h）。从线粒体泄漏的细胞质mtDNA和mtROS分别导致pRIP-MLKL和STING-TBK1-IRF-3信号通路的激活（促进肿瘤消融）（图3i-k），再度提示GSDMDNT-F1LCT mRNA-LNPs抑制肿瘤生长的作用。不过使用Necrox-5（抑制mtROS）和EtBr（抑制mtDNA）可以有效地阻碍这一过程。此外GSDMDNT-F1LCT mRNA-LNPs也可促进LAMP1+溶酶体对AsPC-1细胞线粒体的吞噬，诱导线粒体吞噬。
综上结果表明，GSDMDNT-F1LCT mRNA-LNPs通过形成穿孔损害线粒体，并且通过刺激MLKL信号通路和线粒体自噬，抑制肿瘤生成。
图3 C端F1L肽可将GSDMDNT易位到线粒体中发挥作用
通过GSDMD突变赋予线粒体触发特性
虽然GSDMDNT-F1LCT mRNA-LNPs在非癌细胞系中没有引起严重的线粒体渗漏或质膜毒性，但它们影响了亚细胞，如减少溶酶体和内质网，这可能是磷脂酰肌醇磷酸介导的（图4a，b）。为了减少GSDMD的非特异性亚细胞器膜毒性，作者在其mRNA中引入点突变（hGSDMD），使其在癌细胞中亚细胞器选择性地释放蛋白水解毒性产物。
hGSDMD在细胞质中275处的天冬氨酸残基（D275）处被半胱氨酸/天冬氨酸水解酶切割成GSDMDNT和GSDMDCT。GSDMDCT的独特结构可抑制GSDMDNT在磷脂质膜上的异常成孔活性。作者突变了D275位点(GSDMD p.D275E（c.825 T > A）)，剥夺了半胱天冬酶的水解位点，并限制了GSDMD在细胞质中的亚细胞细胞器毒性（图4c）。
线粒体加工肽酶（PMPCB）是位于mM中的一个β亚基，其中包含一个两亲性的α-螺旋底物绑定空腔,可选择性地识别Phe/Leu/Ile-XX-Ser/Thr/Gly-XXXX底物位点，并在Ser位点进行切割，促进线粒体中核编码蛋白的正确折叠和成熟[2]。根据GSDMD33的晶体结构，作者发现GSDMDCT的α1连接螺旋（18个氨基酸）可以转化为PMPCB的裂解结构域，PMPCB由两个四螺旋重复序列组成：-I（α2-α5）和-II（α6-α7，α9-α10）。这个域形成了一个紧凑的球形褶皱，在空间上被PMPCB识别。另一方面，α8结构太短（只有9个氨基酸），无法终止结构自抑制。为了克服这一限制，作者在突变D275位点的基础上，又创建了hGSDMD c.884 A > G突变体（编码p.E295G的突变株）。该突变理论上可以被PMPCB识别，并具有肽酶底物活性（图4c）。双突变体GSDMD p.D275E/p.E295G（GSDMDENG）获得PMPCB水解底物活性，在体外可被重组hPMPCB裂解成GSDMDNT和GSDMDCT（图4d，e）。
被裂解的hGSDMDENG产物具有针对心磷脂膜的毒性作用（图4f，g）。在转染了LNP封装的HRV2 IRES-LNP-F1LCTmRNA的真核肿瘤细胞中显示出线粒体特异性的切割活性，即GSDMDNT只能在癌细胞的线粒体中检测到（图4h）。GSDMDENG不影响非肿瘤细胞系中溶酶体和内质网的数量，但GSDMDENG诱导肿瘤细胞线粒体碎片，并可抵制ESCRT修复（图4i、j）。并且，重要的是，与GSDMDNT mRNA在癌细胞和非癌细胞中的半抑制浓度相比，HRV2 IRES-GSDMDENG-F1LCTmRNA-LNPs在较低剂量下表现出安全的癌细胞抑制活性（图4k，6g）。
图4 GSDMD碱基修饰可获得线粒体酶水解活性
转基因IVT mRNA的自剪接内含子环状化
mRNA疗法抗病毒机制会大大降低了mRNA的线性半衰期和翻译效率，可能导致不良影响。环状RNA（circRNA）是提高mRNA稳定性的有效策略。
作者使用内含子-外显子（PIE）剪接策略构建环状RNA。具体方法在于：利用T4噬菌体胸苷酸合成酶基因的I型内含子将其与中间断开，将内含子2和内含子1顺序连接。然后将HRV2 IRES、GSDMDc .825 T>A/c.884 A>G ORF、eGFP ORF和F1LCT依次插入到内含子之间。用IVT合成前体RNA，然后加入Mg2+和GTP进行催化环化（图5a）。然而，PIE环化策略未能产生环化产物（图5b）。
为了提高剪接效率，作者在线性RNA的5‘和3’端添加了互补的配对同源臂序列，使剪接位点在空间上更接近（图5c，d）。为了确保剪接核酶的折叠不受高度结构化的HRV2 IRESs的影响，在3‘PIE剪接内含子和HRV2 IRESs序列之间添加了一个间隔序列，使HRV2 IRES和PIE的剪接位点能够独立折叠成二级结构（图5c，d）。同源臂和间隔区将前体RNA环化效率提高到90%以上,且环化产物耐受RNase R切割（图5e）。RNase H质检环状RNA呈现单一条带，而前体RNA产生两条条带（图5f）。此外，Sanger测序结果证实，该产物为一个完整的环状RNA（图5g）。综上数据表明，GSDMDENG环状RNA成功体外制备。
图5 PIE剪接形成环状RNA
GSDMDENG 环状RNA-LNPs消融肿瘤和呈递抗原
HRV2 IRES-GSDMDENG-F1LCT IVT 环状RNA-LNPs (GSDMDENG 环状RNA-LNPs)在体内经过实验显示具有良好的安全性（图6a-c）。在肿瘤小鼠模型中，GSDMDENG 环状RNA-LNPs可消融各种腺癌，并抑制胶质瘤和血液瘤生长（图6d）；其机制在于，GSDMDENG 环状RNA-LNPs驱动EIF4G2+ /PTBP1+肿瘤中GSDMD的表达（图6e，f），并诱导肿瘤线粒体吞噬和肿瘤抗原呈递，参与肿瘤消融。
线粒体吞噬对于内溶酶体呈递线粒体抗原至关重要。为了确认GSDMDENG 环状RNA-LNPs诱导的线粒体吞噬是否能触发适应性抗肿瘤免疫，作者使用慢病毒构建了AsPCs-mtOVA-msCherry稳转细胞（可编码线粒体定位的OVA和mCherry荧光），经过实验证实了GSDMDENG 环状RNA-LNPs诱导的线粒体吞噬可以触发适应性抗肿瘤免疫。
图6 GSDMDENG 环状RNA-LNPs的安全性和有效性
GSDMDENG 环状RNA-LNPs预防KRASG12D腺癌
大约30%的人类肿瘤存在RAS基因突变，其中KRAS是最常见的突变成员。基因分析显示，在弥漫性大b细胞淋巴瘤（DLBC）、胰腺腺癌（PAAD）、结肠腺癌（COAD）、LUAD和多形性胶质母细胞瘤（GBM）中，KRAS与EIF4G2/PTBP1的高表达呈正相关（图7a，b）。KRAS经常在G12处突变，尤其是在手术切除的PAAD、COAD和LUAD癌组织中，特别是KRASG12D突变（图7c，d）。作者亦发现，在KRASG12D突变小鼠的胰腺、肺和结肠中，EIF4G2和PTBP1的表达表现出年龄依赖性的趋势（图7e），这可能是KRAS异常激活Raf-MEK-MAPK信号通路有关[3]。因为有结果显示，CH51226766（Raf-MEK-MAPK信号抑制剂）减弱KRASG12D小鼠中EIF4G2和PTBP1的表达（图7e）。研究表明，激活Raf-MEK-MAPK信号通路有利于HRV2 IRES的启动，使HRV2 IRES驱动的GSDMDENG 环状RNA-LNPs成为肿瘤发生（KRAS突变驱动）的潜在预防性治疗方法。
除此之外，GSDMDENG 环状RNA-LNPs也被证实能够动员抗肿瘤免疫来保护KRASG12D突变诱导的腺癌发生，比如降低肿瘤联合发生率，提高机体生存率，激活树突状细胞和提高细胞毒性T细胞免疫。
图7 GSDMDENG 环状RNA-LNPs可对KRAS突变引起泛腺癌进行预防性治疗
小结
作者通过多种设计和传递策略，设计了一个独特的环状RNA——GSDMDENG 环状RNA-LNP，它具有肿瘤特异性表达和条件性激活的双重特性。HRV2-IRES结构确保了其在KRAS突变驱动EIF4G2/PTBP1激活的癌症细胞中的翻译起始，而双突变氨基酸位点和改造C末端信号肽使其具备定位和激活线粒体。环化策略和LNP包封增强其在体内的表达和递送效率，以及减弱免疫。GSDMDENG 环状RNA-LNP可有效消除肿瘤小鼠模型的肿瘤负担，间接赋予KRAS突变小鼠的抗肿瘤免疫。这些综合策略为使用GSDMDENG 环状RNA-LNP治疗和预防KRAS突变诱导的泛腺癌提供了巨大的前景；也为环状RNA替代mRNA靶向肿瘤药物和疫苗再次奠定了研究基础。
图8 GSDMDENG 环状RNA-LNP的设计和传递策略
参考文献：
[1] Ding, J. et al. Pore-forming activity and structural autoinhibition of the gasdermin family. Nature 535, 111–116 (2016).
[2] Taylor, A. B. et al. Crystal structures of mitochondrial processing peptidase reveal the mode for specific cleavage of import signal sequences. Structure. 9, 615–625 (2001).
[3] Yan, L. et al. Targeting glucose metabolism sensitizes pancreatic cancer to MEK inhibition. Cancer Res. 81, 4054–4065 (2021).
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s43018-023-00650-8
