胰腺癌以高恶性肿瘤和有限的治疗选择，被认为是重大的全球卫生挑战。化疗虽然是改善局部晚期或转移性胰腺癌预后的最有效手段之一，但化疗耐药性却是一个临床障碍。胰腺癌最有效的化疗方案是叶酸，奥沙利铂是关键的活性药物。但是，目前数据来看，只有21%的胰腺癌患者对铂类药物敏感。因此，需要研究胰腺癌中铂耐药的机制以及如何提高铂敏感性，为治疗胰腺癌提供思路。
细胞外囊泡（EVs）是一种新的细胞间通信手段，可携带各种生物活性分子来调节受体细胞的活性。并且环状RNA（circRNAs）在EV中丰富且稳定，可在细胞间发挥特定功能。已有研究发现外泌体中的circRNA在介导肝细胞癌顺铂化疗耐药中的重要作用。但是针对EV包裹的circRNA在胰腺癌铂耐药中的作用未被广泛探索。
今年6月份，广东省人民医院陈汝福教授团队在Cancer Research（IF=11.2)发表文章，挖掘到了淋巴结转移性胰腺导管腺癌的潜在治疗靶点-circARFGEF2，为胰腺癌的诊断和治疗提供有力的参考依据。
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同年11月28日，广东省人民医院陈汝福教授团队在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF=11.3）再度发表circRNA在胰腺癌诊断/治疗方向的最新文章Extracellular vesicle-packaged circBIRC6 from cancer-associated fbroblasts induce platinum resistance via SUMOylation modulation in pancreatic cancer。在本研究中，作者发现了一种环状RNA-circBIRC6，富集于肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）产生的EV中，在胰腺导管腺癌（PDAC）的化疗耐药性中起着关键作用。circBIRC6在CAF中的表达同奥沙利铂的化疗耐药性呈正相关。circBIRC6可通过调节非同源端连接（NHEJ）依赖的DNA修复，增强了胰腺癌细胞和类器官的奥沙利铂耐药性。具体机制在于，circBIRC6直接与XRCC4结合，增强XRCC4与SUMO1在赖氨酸115残基上的相互作用，从而促进XRCC4染色质的核定位，增加奥沙利铂耐药性。组合奥拉帕尼和circBIRC6和单独circBIRC6的抑制剂可显著抑制奥沙利铂化疗耐药性。
circBIRC6与奥沙利铂耐药密切相关
为了研究铂类化疗耐药性中参与CAF的关键环状RNA，我们对奥沙利铂耐药患者的CAFs及正常邻近组织相关成纤维细胞（NAFs）进行了高通量测序+qPCR分析，筛选出10个上调的circRNA（图1A）。但在这些circRNA中，仅有circBIRC6在奥沙利铂耐药患者的CAFs表达明显高于奥沙利铂灵敏患者；并且高表达的circBIRC6与较短的无进展生存期（PFS）密切相关（图1C-E）；无铂化疗方案治疗的患者，circBIRC6表达与PFS没有关系了（图1F）；这提示circBIRC6与奥沙利铂耐药息息相关。circBIRC6起源于BIRC6基因的第2~10外显子，成环验证和RNase R和放线菌素D实验验证其环化和耐受性（图1G-I）。综上提示，circBIRC6是一个共价封闭的环状RNA，并与奥沙利铂耐药有密切关系。
作者进一步阐明导致circBIRC6在铂耐药PDAC中上调的分子机制。RNA结合蛋白（RBPs）调节circRNA的生成已有文献报道。CircInteractome分析和qPCR的结果以及RIP的验证显示，EIF4A3蛋白与circBIRC6结合，并促进circBIRC6的生成。
图1 circBIRC6与奥沙利铂耐药密切联系
circBIRC6被包装成EV，可传递到肿瘤细胞中
前面提到circBIRC6富集在CAF中而非NAF。有趣的是，circBIRC6也富集CAFs的培养基（CM）而非NAFs（图2A-B）。与NAF-CM共培养或单独培养的PDAC细胞相比，CAF-CM共培养的PDAC细胞系中circBIRC6水平显著升高，提示circBIRC6可传递到PDAC细胞系中。细胞外circBIRC6研究发现，RNase处理没有影响CAF-CM中circBIRC6的水平；而RNase和Triton X-100（通透液）联合处理可降低CAF-CM中circBIRC6的水平（图2C），提示circBIRC6可能存在CM的EV中。此外，用α-鹅膏蕈碱处理Panc-1细胞（CAF-CM共培养）抑制内源性转录，并不影响Panc-1细胞中circBIRC6的升高（图2D），再度提示EV-circBIRC6可传递到Panc-1细胞中，产生富集。综上提示，CAF-CM中富集EV-circBIRC6，并且可以传递到肿瘤细胞中。
为了证实细胞外circBIRC6被包裹在EV中，作者从CAF-CM中分离了EV。NanoSight和WB验证了ev的形态、大小和生物标志物（图2E-G）。EV中circBIRC6的水平与CAF-CM中几乎相同（图2H），这意味着circBIRC6在caf分泌的EV中富集，而不是直接释放。此外，血浆EV包裹的circBIRC6水平与来自配对CAF-EV-circBIRC6呈正相关（图2I），表明血浆EV-circBIRC6主要来自PDAC微环境中的CAF。
图2 CAF-EV-circBIRC6可传递到肿瘤细胞中
离体研究——CAF-EV-circBIRC6促进奥沙利铂耐药
为了探索CAF-EV-circBIRC6在体外调控奥沙利铂耐药，作者分别先在过表达和敲低circBIRC6的CAFs中分离EV（图3A-B）；随后，将PDAC细胞系与这些EV共孵育。结果显示，过表达circBIRC6的CAF-EV对奥沙利铂治疗表现出了更高的半抑制浓度值和更高的细胞增殖，而沉默circBIRC6则相反（图3C-F）。此外，CAF-EV-circBIRC6可减弱奥沙利铂诱导的PDAC细胞凋亡，促进胰腺癌类器官增殖；而CAF-EV-sh-circBIRC6则相反（图3G-J）。综上表示，离体研究中，CAF-EV-circBIRC6可正向调控奥沙利铂耐药性。
图3 CAF-EV-circBIRC6可正向调控奥沙利铂耐药性
circBIRC6通过NHEJ通路诱导奥沙利铂耐药
为了进一步阐明EV-circbirc6驱动的奥沙利铂耐药机制，作者对敲低circbirc6的CAF和对照细胞进行测序和KEGG分析，发现富集在DNA修复途径上（图4A）。双链DNA断裂（DSB）修复被认为是奥沙利铂耐药的关键机制之一。随后，作者使用中性彗星实验（检测DNA双链的断裂损伤）研究EV-circbirc6是否改变了PDAC细胞中DSB修复的效率。结果显示，CAF-EV-circbirc6组有更短的彗星尾，且γH2AX水平降低，CAF-EV-sh-circbirc6组则相反，提示circbirc6对DSB修复的促进作用（图4B-E）。HR和NHEJ是DSB修复的关键途径。CAF-EV-circbirc6提高了NHEJ的效率，但没有提高HR（图4F-G）。SCR7可抑制NHEJ通路，实验结果显示，SCR7可逆转CAF-EV-circbirc6促进肿瘤细胞增殖的作用；γH2AX分析结果与之一致（图4H-I）。综上结果表明，circBIRC6通过NHEJ通路介导奥沙利铂耐药，而阻断NHEJ通路可消除circBIRC6对奥沙利铂耐药的影响。
图4 circBIRC6通过NHEJ通路诱导奥沙利铂耐药
circBIRC6与XRCC4结合
为了确定circBIRC6提高NHEJ修复效率的机制，作者又通过RNApulldown+MS+WB+RIP实验确定在PANC-1细胞中circBIRC6结合XRCC4（图5A-E）。CAF-EV-sh-circBIRC6不影响Panc-1细胞中XRCC4 mRNA和蛋白水平（图5F-G）。令人惊讶的是，作者发现CAF-EV-circBIRC6增强了XRCC4向染色质的募集（促进XRCC4核定位，可提高NHEJ修复效率），CAF-EV-sh-circBIRC6则相反（图5H）。接下来，作者合成了circBIRC6的分段探针，并确定了circBIRC6的400-600nt区域对于XRCC4的相互作用是至关重要的（图5I-J）。非编码RNA通常通过茎环结构与蛋白质相互作用。我们预测circBIRC6（500-545）是形成了双链茎环结构（图5K），关于这个位点的突变也削弱了XRCC4蛋白RIP下来的circBIRC6的量以及XRCC4核定位（图5L-M）。
图5 circBIRC6与XRCC4结合
EV-circBIRC6通过SUMO修饰正向调控XRCC4定位
翻译后的修饰（PTMs）在蛋白质定位中是非常重要的。为了确定参与XRCC4核定位的关键PTM，我们用CAF-EV和各种PTM抑制剂处理PANC-1细胞。CAF-EV促进XRCC4核定位；抑制SUMO修饰（2-D08）可抑制XRCC4核定位（图6A）。CO-IP结果也证实了sh-circBIRC6显著降低修饰因子SUMO1与XRCC4的连接，但没有显著改变XRCC4的泛素化、磷酸化或甲基化（图6B）。这提示circBIRC6影响XRCC4的SUMO修饰。Co-IP分析表明，circBIRC6增强了XRCC4与SAE1（sumo激活酶）互作（图6C）。si-SAE1可减轻SUMO1对XRCC4的修饰，并抑制了XRCC4的核定位（图6D-E）。考虑到修饰残基在SUMO修饰对靶蛋白影响中的重要作用，我们利用GPS-SUMO（预测SUMO修饰），确定了XRCC4上两个潜在的SUMO修饰位点（K115和K210）（图6F-G）。实验表示，K115R突变而不是K210R突变显著阻碍了XRCC4的SUMO修饰和核定位（图6H-J）。然后，作者研究了SUMO修饰依赖的XRCC4核定位是否对EV-circBIRC6介导的奥沙利铂耐药是必要的。结果显而易见，XRCC4的K115R突变抵消了EV-circBIRC6诱导的奥沙利铂耐药（图6K）。综上所述，EV-circBIRC6是通过SUMO修饰途径促进XRCC4核定位，从而促进奥沙利铂耐药。
图6 EV-circBIRC6通过SUMO修饰正向调控XRCC4核定位，促进奥沙利铂耐药
在体研究——EV-circBIRC6诱导胰腺癌奥沙利铂耐药
为了研究EV-circBIRC6在体内的作用，将XRCC4-WT或XRCC4-Mut转导的PANC-1细胞注射到小鼠的胰腺尾部，并用奥沙利铂和CAF-EV处理原位异种移植小鼠（图7A）。静脉注射CAF-EV-circBIRC6导致化疗效果不佳，肿瘤体积更大，DSBs水平和细胞凋亡水平降低，而XRCC4突变可逆转这些效应，抑制肿瘤生长（图7B-F）。
为了评估circBIRC6/XRCC4轴的潜在治疗价值，作者在临床奥沙利铂耐药患者建立了患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型，并使用靶向circBIRC6的反义寡核苷酸（ASO）抑制剂进行治疗（图7G）。与预期的一样，ASO-circBIRC6的治疗显著改善了化疗反应。此外，奥沙利铂与ASO-circBIRC6和奥拉帕尼联合使用，显著提高了化疗反应（图7H）。IHC分析显示，ASO-circBIRC6或ASOcircBIRC6联合奥拉帕尼治疗可增加DSBs水平和细胞凋亡（图7I）。综上所述，CAF-EV-circBIRC6通过SUMO修饰途径正向调控XRCC4核定位，促进奥沙利铂耐药。
图7 EV-circBIRC6诱导胰腺癌奥沙利铂耐药
circBIRC6与PDAC患者的DNA损伤和奥沙利铂耐药相关
为了评估circBIRC6对奥沙利铂化疗反应的预测价值和临床意义，作者检测了82例接受奥沙利铂化疗的晚期PDAC患者中circBIRC6在血浆EV和原发肿瘤组织中的表达，并通过免疫染色评估γH2AX的DNA损伤水平。结果显示，耐药患者肿瘤组织中circBIRC6水平相对不耐药的组织升高，γH2AX水平降低（图8A-C）；circBIRC6的表达与γH2AX的表达呈负相关（图8D）；作者也检测了SUMO修饰的XRCC4水平，发现耐药患者肿瘤组织中XRCC4水平升高，化疗反应性变弱（图8E-G)。此外，与奥沙利铂反应灵敏患者相比，耐药性患者血浆EV-circBIRC6水平升高（图8H）。Kaplan-Meier分析显示，血浆EV-circBIRC6含量越高，PFS就越短（图8I）。不过有趣的是，在接受其他无奥沙利铂化疗方案的患者中，无论血浆ev-circBIRC6水平如何，PFS均无显著差异（图8J）。综上所述，circBIRC6可作为基于奥沙利铂的胰腺癌化疗耐药性的潜在治疗和生物标志物（图8K）。
图8 circBIRC6与PDAC患者的DNA损伤和奥沙利铂耐药相关