中国药科大学研究团队揭示胃癌中高表达的环状RNA hsa_circ_0136666具有促进胃癌增殖和肿瘤免疫逃逸的功能

环状RNA（circRNAs）是一种丰富且高度保守的非编码RNA。越来越多的研究表明环状RNA在癌症的致病机理中可能发挥生理作用，包括在癌症转移、预后等进程，但相关机制尚不明确。

2023年11月3日，中国药科大学邢莹莹副教授、郑禄枫副教授、唐昕莹副研究员研究团队在Molecular Cancer（IF=37.3）发表文章“Hsa_circ_0136666 stimulates gastric cancer progression and tumor immune escape by regulating the miR-375/PRKDC Axis and PD-L1 phosphorylation”。本研究结果揭示了hsa_circ_0136666在胃癌中发挥的致癌作用，通过miR-375/PRKDC信号轴驱动PD-L1磷酸化，促进免疫逃逸。这项工作提出了一种全新的胃癌致病机制，揭示了hsa_circ_0136666作为免疫靶点的新作用，并为增强抗PD-L1治疗胃癌的疗效提供了理论依据。

Hsa_circ_0136666与miR375有交叉点，而Hsa_circ_0136666与胃癌的生长呈正相关

作者在之前的研究中发现，miR-375可以抑制胃癌的进展，且miR-375的过表达导致包括环状RNA在内的长非编码RNA的异常变化。推测其可能受到上游分子的调控。为了鉴定潜在的为miR-375海绵的环状RNA，作者通过基因表达综合数据库（GEO）和ENCORI在线数据库筛选发现唯一一个与miR- 375结合位点的circPRKDC，即hsa_circ_0136666。

RNase R酶和放线菌素D以及oligo dT实验表明，相比PRKDC，hsa_circ_0136666具有更强的稳定性（图1d-f）。荧光探针检测结果显示hsa_circ_0136666能在不同阶段的胃癌组织中广泛表达（图1g）。与正常组织相比，hsa_circ_0136666在原位癌组织中的表达水平较高，其次是癌旁组织和转移组织（图1h），说明hsa_circ_0136666在胃癌的发生发展中的重要作用。综上所述，hsa_circ_0136666具有不易降解的环状结构，在胃癌组织中高表达，推测hsa_circ_0136666调控胃癌的发生发展。

Hsa_circ_0136666促进肿瘤增殖和肿瘤免疫逃逸

作者发现hsa_circ_0136666在不同的胃癌组织和肿瘤细胞系中广泛表达。且相比正常胃上皮细胞GES-1相比，肿瘤细胞系中hsa_circ_0136666的表达丰度更高（图2a）。因此，hsa_circ_0136666在胃癌中高表达。

Hsa_circ_0136666在肿瘤生长过程中的作用至关重要。CCK-8实验发现过表达hsa_ circ_0136666可促进癌细胞增殖（图2d-e），而使用siRNA敲低hsa_ circ_0136666可抑制细胞生长（图2f-g）。Circular RNA interactome显示，在hsa_circ_0136666前mRNA的上游和下游有EIF4A3的4个结合位点。EIF4A3的存在持续促进了胃癌细胞的生长速率（图2h）。相反，EIF4A3基因的下调则抑制了细胞的生长速率（图2i）。

结合之前的研究，作者探讨了hsa_circ_0136666如何通过免疫途径调节肿瘤生长。结果显示，过表达hsa_circ_0136666的癌细胞在与分离的、再活化的CD8+ T细胞共培养下，存活率增加，而hsa_circ_0136666的下调逆转了这一趋势（图2j-k）。推测hsa_ circ_0136666有助于肿瘤细胞对抗肿瘤免疫。

接着作者发现hsa_ circ_0136666与免疫检查点分子密切相关。Hsa_circ_0136666可以显著增加免疫检查点蛋白的表达量，特别是PD-L1，敲低Hsa_circ_0136666则降低了PD-L1的表达。综上所述，hsa_circ_0136666在体外可有效促进肿瘤细胞增殖的情况下，不被免疫细胞检测到，且hsa_circ_0136666的生物合成也受到EIF4A3的调控。

Hsa_circ_03666调节向免疫逃逸驱动的抗肿瘤免疫反应

作者利用小鼠胃癌细胞构建同源肿瘤移植模型。结果表明，接种MFC-hsa_circ_0136666细胞的荷瘤C57BL/c小鼠具有更快的肿瘤生长速率和更大的肿瘤重量（图3a-c）。说明hsa_circ_0136666导致小鼠肿瘤生长进展过程中癌症恶化。

接着作者探讨了hsa_circ_0136666是否参与TME中的免疫细胞迁移，结果表明，hsa_circ_0136666过表达后，肿瘤膨胀的T细胞总数显著减少，在抗肿瘤免疫抵抗期，肿瘤相关的巨噬细胞向M2期极化（图3d-e）。结果表明，在hsa_circ_0136666存在的情况下，肿瘤生长向恶性肿瘤发展。

细胞因子在细胞免疫中也起着关键作用。研究发现，IFN-γ和IL-6在过表达hsa_circ_0136666的肿瘤组织中呈上升趋势，而TGF-β没有明显的变化。然而，这些促癌因子在表达下调的组织中表现出下调的趋势（补充图3c-e）。对致瘤区病理切片的免疫组化分析显示，局部恶化更严重，PD-L1表达更多（补充图3f）。综上所述，hsa_circ_0136666在体内促进了肿瘤的快速生长和免疫微环境的形成。

Hsa_circ_0136666通过miR-375海绵调控胃癌进展

miR-375可以抑制幽门螺杆菌诱导的胃癌发生，幽门螺杆菌可以通过下调miR-375的表达来抑制胃内炎症因子的水平和免疫细胞的分化。研究发现，hsa_circ_0136666与miR-375的表达呈负相关（图4a）。作者利用starBase v2.0，预测了hsa_circ_0136666和miR-375的结合区域（图4b）。接着通过RIP实验证实两者的相互结合。Argonaute 2（AGO2）是RISC复合物的关键组成部分，使用抗AGO2抗体可拉下与野生型hsa_ circ_0136666结合的miR-375（图4c和补充图5e）。双荧光素酶报告基因检测也证实hsa_ circ_0136666可以与miR-375结合（图4d）。同时，RNA荧光原位杂交实验结果表明hsa_circ_0136666主要存在于细胞质中，与miR-375的分布几乎相同（图4e）。此外，miR-375还具有调节肿瘤免疫的功能。转染miR-375模拟物的癌细胞在与分离和再活化的CD8+ T细胞共培养时存活率降低，而转染miR-375抑制剂的癌细胞存活率有所提高（图4f）。

接着，作者验证了miR-375对C57BL/c荷瘤小鼠肿瘤生长的影响（图4g）。发现过表达miR-375也能降低肿瘤生长速率和肿瘤重量，miR-375抑制剂能显著促进肿瘤生长，增加肿瘤重量（图4h-i）。同时，miR-375过表达后，肿瘤区域的T细胞的扩增明显增加，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞均呈增加趋势（图4j）。而miR-375抑制剂组的T细胞增殖现象被逆转（图4k）。综上所述，hsa_ circ_0136666海绵吸附miR-375从而抑制miR-375发挥生理作用。

Hsa_circ_0136666通过miR375/PRKDC信号轴调节免疫应答

作者进一步验证了miR-375的功能，在过表达miR-375的基因芯片上，共检测到1777个上调基因和262个下调基因（图5a）。同时，通过数据库预测了miR-375和亲本基因PRKDC 3’UTR区域的配对序列（图5b）。QRT-PCR实验发现，过表达Hsa_circ_0136666上调PRKDC的表达，而下调Hsa_circ_0136666下调PRKDC的表达（补充5a-b）。同时，miR- 375与PRKDC mRNA水平之间存在显著的负相关关系（补充5c-d）。在RIP和双荧光素酶实验中证实了两者的结合（图5c-d和补充图5f）。

PRKDC mRNA主要分布在细胞质中，与miR-375的分布几乎相同（图5e）。miR-375可同时调控PRKDC编码蛋白DNA-PKcs的表达。它是DNA依赖蛋白激酶（DNA-PK）的催化亚基，在DNA双链断裂修复和重组中作为Ku70/Ku80异二聚体蛋白发挥作用。MKN-45和AGS细胞转染miR-375模拟物和miR-375抑制剂后，分别测定了总蛋白表达量。结果表明，miR-375抑制PRKDC的表达，导致DNA-PK下调（图5f和补充图5g-j）。

此外，高浓度的NU-7441（一种DNA-PK选择性抑制剂）表现出良好的肿瘤抑制作用（图5g-h）。与对照组相比，高浓度的NU-7441显著增加了T细胞的招募（图5i），从而激活免疫系统，快速杀死癌细胞（图5j）。

综上所述，hsa_circ_0136666作为一种miR-375海绵，可以防止miRNAs降解靶基因，从而使DNA-PK发挥促癌作用，导致免疫逃逸的发生。

蛋白激酶DNAPK驱动PDL1T20T22双位点磷酸化，介导蛋白稳定

PRKDC和免疫检查点PD-L1之间有很强的相关性。所以作者提出假设：蛋白激酶可能直接结合PD-L1并磷酸化，介导PD-L1蛋白稳定性上调，从而丰富并促进肿瘤免疫逃逸。为此，作者首先对肿瘤细胞进行了内源性验证。PD-L1蛋白可以用DNA-PK（mAb）拉下，反之亦然（图6a）。在转染了hsa_circ_0136666或miR- 375模拟物的HEK- 293 T细胞中，随着DNA-PK的上调，下拉蛋白显著增加（图6b-c）。免疫荧光也证实了DNA-PK与PD-L1在细胞质中共定位（图6d）。

由于DNA-PK属于PI3K激酶超家族，那么PRKDC是否可以直接磷酸化PD-L1。于是作者通过补回实验发现，hsa_circ_0136666的加入导致PD-L1磷酸化水平的上调，而miR- 375可以逆转这种上调（图6e）。NU-7441可以抑制DNA-PK激酶的活性，PD-L1的表达也被NU-7441抑制（图6f）。

在验证了DNA-PK直接与PD-L1结合的基础上，作者进一步验证DNA-PK驱动PD-L1的磷酸化。在HEK-293 T细胞中，DNA-PK抗体下拉后，质谱分析发现7个潜在的PD-L1磷酸化位点（补充图6a）。对这7个位点进行了突变，检测磷酸化蛋白表达水平。发现T20A和T22A两个位点磷酸化的蛋白水平显著下调（图6g）。相比之下，当仅保持一个位点未发生突变时，磷酸化蛋白的水平均有所上调（图6h）。此外，在MKN-45 hsa_circ_0136666过表达细胞中，PD-L1双磷酸化位点（T20A T22A）突变比单位点突变更能下调PD-L1的磷酸化（图6i-j）。在CHX处理后，PD-L1的稳定性不如野生型蛋白，且在6h内降解程度更强（图6k-l）。临床数据也表明胃腺癌组织样本中DNA-PK和PD-L1呈极高的正相关关系（图6m）。

综上所述，蛋白激酶DNA-PK与PD-L1的直接结合且共定位。DNA-PK在T20-T22双位点磷酸化PD-L1，使PD-L1不易降解，并提高PD-L1蛋白的稳定性，使PD-L1聚集，从而促进免疫失调。

Hsa_circ_0136666是一种新的药物靶点，可以有效改善抗PD-L1的药物靶点

为了验证hsa_circ_0136666是否可以作为一个有效的药物靶点，作者在C57BL/c小鼠中建立了一个皮下模型（图7a）。简单地说，MFC细胞过表达hsa_circ_0136666的荷瘤小鼠被随机分为4组，并在瘤内注射LNP-siRNA，si-circRNA的敲低效率可达到50%（图7b）。同时，腹腔注射抗小鼠PD-L1单抗（aPD-L1），实验结果表明，LNP-siRNA+aPD-L1组的肿瘤大小和重量在四组中最小，相比对照组抑制率约为50%-60%（图7c-f）。四组小鼠的体重没有明显变化，说明两种药物没有明显的毒性（图 7d）。

siRNA能够抑制肿瘤的生长，但与单抗治疗相比，这种抑制率并不显著。然而，LNP-siRNA有助于肿瘤微环境的治疗，主要通过抑制免疫细胞的比例。肿瘤免疫抑制细胞（MDSCs）经LNP-siRNA治疗后，肿瘤区域明显被抑制，而LNP-siRNA+aPD-L1组的MDSCs数量在四组中最小。同样，肿瘤浸润调节性T细胞在所有LNP-siRNA治疗组中数量都较少，而在未接受LNP-siRNA治疗的组中数量则较多（图7g）。

综上所述，LNPsiRNA可以有效地改善抗PD-L1药物的抗肿瘤效果，并显著阻碍免疫抑制细胞的募集。LNP-siRNA无明显的副作用，可作为进一步在体内应用的安全药物。

总结

本研究表明在胃癌中高表达的环状RNA hsa_circ_0136666具有促进胃癌增殖和肿瘤免疫逃逸的功能，通过hsa_circ_0136666/miR-375/PRKDC信号轴调控蛋白激酶DNAPK对PD-L1的磷酸化，抑制PD-L1蛋白降解，导致PD-L1的异常积累，引发免疫逃逸。利用纳米脂质颗粒（LNPs）包裹靶向hsa_circ_0136666的siRNA，能够显著阻碍肿瘤免疫抑制细胞MDSCs与Treg细胞的招募，有效提高抗PD-L1治疗的效果。该研究为寻找胃癌治疗和预后新靶提供了理论基础，为开发胃癌治疗的小RNA药物提供新的思路。

原文链接：

https://doi.org/10.1186/s12943-023-01883-y