肝内胆管癌（ICC）是第二大常见的原发性肝癌，其发病率和死亡率持续上升。多项研究表明，异常表达的环状RNA可能是许多癌症的潜在诊断和治疗靶点，包括ICC。ERK通路包括RAS、RAF、MEK和ERK，它们在近40%的癌症中发生了改变。然而，ERK通路与环状RNA之间的关系尚不清楚，有待进一步研究。丝氨酸-苏氨酸激酶受体相关蛋白（STRAP）是WD-40重复蛋白家族的一个成员，在人类癌症中调控许多通路，包含MEK/ERK通路。由于目前还没有关于STRAP在ICC中的功能的研究，因此探索其在ICC形成的起始过程中的作用至关重要。
2024年2月17日，江苏省人民医院、南京医科大学第一附属医院肝胆中心李相成教授、李长贤副主任医师团队研究发现在Molecular Cancer(IF=37.3)发表文章CircPCNXL2 promotes tumor growth and metastasis by interacting with STRAP to regulate ERK signaling in intrahepatic cholangiocarcinoma。本研究表明circPCNXL2通过与STRAP相互作用激活ERK信号通路，以及调节miR-766-3p/SRSF1轴，在ICC进程中发挥关键作用。这些发现表明，circPCNXL2可能是ICC的一个潜在的生物标志物和治疗靶点。
circPCNXL2鉴定和circPCNXL2在ICC中表达上调
为了评估环状RNA在ICC中的作用，作者分析了来自ICC和邻近组织的RNA-seq数据。结果显示，has_circ_0016956（circPCNXL2）是上调最多的环状RNA之一，通过qRT-PCR也证实其在ICC组织中过表达（图1a-c）。根据circPCNXL2的中位表达量，将76例ICC患者分为低circPCNXL2组和高circPCNXL2组。观察到circPCNXL2的高表达与TNM晚期相关，且高circPCNXL2组的患者总生存率（OS）较差（图1d）。总之，circPCNXL2在ICC的发展和转移中具有潜在的作用。
circPCNXL2在4个ICC细胞系中的表达也较高，所以作者选择了HuCCT1和RBE细胞进行后续研究（图1e）。然后通过Sanger测序和PCR分析验证了circNIPBL的反向剪接结构（图1f）。然后运用背靠背引物经琼脂糖凝胶电泳，结合RNase R耐受性检测实验，表明circPCNXL2的环状结构相对更稳定（图1h-i）。通过FISH和细胞质和核RNA纯化分析，circPCNXL2主要位于细胞质中（图1j-l）。综上所述，circPCNXL2在ICC组织中过表达，主要位于ICC细胞的细胞质中。
图1 circPCNXL2鉴定和circPCNXL2在ICC中表达上调
CircPCNXL2促进体外ICC的增殖和迁移
为了阐明circPCNXL2在ICC中的生物学功能，作者利用靶向剪接的siRNA敲低circPCNXL2的表达，并构建circPCNXL2过表达质粒（图2a-b）。然后，通过CCK-8法、EdU法和克隆形成法检测circPCNXL2对细胞增殖的影响。结果表明，下调circPCNXL2可抑制HuCCT1和RBE细胞的增殖，circPCNXL2过表达组与之相反（图2c-f）。同样，transwell实验和伤口愈合实验表明，敲低circPCNXL2阻碍了迁移能力，过表达circPCNXL2促进了迁移能力（图2g-j）。综上所述，circPCNXL2在ICC细胞中具有致癌作用。
图2 CircPCNXL2促进体外ICC的增殖和迁移
CircPCNXL2在体内促进ICC的肿瘤生长和转移
为了评估circPCNXL2在体内对ICC的影响，作者构建了异种移植模型，与对照组相比circPCNXL2敲低的肿瘤的体积更小，而过表达circPCNXL2组肿瘤生长速度快于对照组（图3a-f）。免疫组化（IHC）染色显示，circPCNXL2基因敲低组的Ki-67水平较弱。相反，circPCNXL2的过表达导致Ki-67染色更强，表明Ki-67与circPCNXL2的表达水平之间存在相关性（图3g-h）。综上所述，circPCNXL2在体内促进了ICC的增殖。
然后，为了检测circPCNXL2在ICC体内的转移特征，作者构建了肝转移模型。结果表明，注射了circPCNXL2敲低的HuCCT1细胞的小鼠肝脏中转移性结节的数量显著减少。并且，circPCNXL2过表达增强了肝脏的扩散能力（图3i-k）。综上所述，circPCNXL2促进了ICC细胞在体内的转移。
图3 CircPCNXL2在体内促进ICC的肿瘤生长和转移
CircPCNXL2在ICC中调节ERK/MAPK信号通路的激活
为了分析circPCNXL2促进ICC细胞增殖和转移的潜在机制，作者通过RNA-seq在过表达circPCNXL2的RBE细胞中鉴定了278个差异表达基因（图4a）。KEGG通路分析和GO富集分析表明显示，MAPK信号通路最为丰富，且circPCNXL2可能在ICC进展中调控MAPK通路的ERK1和ERK2级联（图4b）。作者由此推测circPCNXL2可能通过MAPK通路促进ICC的生长和转移。通过WB结果证实了这一点，且ERK磷酸化的变化在三个亚群中最为显著，与GO富集的结果一致。因此，作者假设circPCNXL2主要通过ERK/MAPK信号通路促进ICC的肿瘤发生。
为了了解ERK/MAPK通路在circPCNXL2介导的ICC进展中的意义，作者通过ERK抑制剂SCH772984来阻断ERK的磷酸化（图4d-e）。在功能上，EdU试验、CCK8试验、克隆形成试验、transwell试验和伤口愈合试验表明，过表达circPCNXL2可促进增殖和迁移，而SCH772984可以逆转这些现象（图4f-j）。综上所述，circPCNXL2通过激活ERK/MAPK信号通路促进了ICC的生长和迁移。
图4 CircPCNXL2在ICC中调节ERK/MAPK信号通路的激活
CircPCNXL2与STRAP相互作用，介导ERK/MAPK信号通路的激活
为了研究circPCNXL2如何调控ICC中ERK的磷酸化，作者通过RNA pulldown实验，结合银染分析和MS分析，在大约40 KD处观察到一个特定的条带，条带可能能够与circPCNXL2结合（图5a-b）。接下来，RNA pulldown、RIP检测和FISH证实了circPCNXL2和STRAP之间的相互作用（图5c-e）。但是，circPCNXL2的敲低或过表达对STRAP的表达没有产生影响（图5g-h）。由此推测circPCNXL2可能作为促进ERK激活的支架。作者通过IP和Western Blot检测实验表明，STRAP可以与MEK1/2结合（图5i-j）。接着，为了研究circPCNXL2是否对ICC中STRAP和MEK1/2之间的相互作用有影响，作者在circPCNXL2过表达或敲低的HuCCT1和RBE细胞中的STRAP或MEK1/2抗体进行了免疫共沉淀实验。结果表明，circPCNXL2的过表达可以促进STRAP与MEK1/2之间的结合，而不改变其蛋白水平（图5k-l）。同时，结果进一步证实，circPCNXL2也参与了ERK1/2-MEK1/2的相互作用，并促进ERK1/2的磷酸化（图5m-n）。综上所述，在ICC中，circPCNXL2可以与STRAP相互作用，促进STRAP与MEK1/2的关联，并负责MEK1/2磷酸化ERK1/2。
此外，为了分析circPCNXL2与STRAP相互作用的精确结合域，作者设计了一系列flag标记的STRAP缺失突变体用于RIP和RNA pulldown分析。结果显示，第4个和第5个WD-40结构域负责STRAP与circPCNXL2的结合（图5o-q）。
图5 CircPCNXL2与STRAP相互作用， 介导ERK/MAPK信号通路的激活
CircPCNXL2通过海绵化miR-766-3p上调SRSF1的表达
RIP显示，在HuCCT1和RBE细胞中，AGO2抗体显著富集circPCNXL2，表明circPCNXL2可能在ICC中发挥miRNA抑制作用。作者通过使用生物素标记的circPCNXL2探针进行RNA pulldown分析，与预测的miRNA结合，miR- 766-3p是最富集的miRNA（图6b）。RIP检测结果显示，miR-766-3p被AGO2抗体富集，而不是被IgG抗体富集（图6c）。另外作者也证实，与正常组织相比，miR-766-3p在ICC组织中表达下调，ICC患者的低水平miR-766-3p与不良生存率相关，miR-766-3p在ICC组织中的表达与circPCNXL2水平呈负相关（图6 d-f）。此外，双荧光素酶报告分析结果表明，circPCNXL2在ICC中起着miR-766-3p海绵的作用（图6g）。
为了研究miR-766-3p在ICC生长中的作用，作者在HuCCT1或RBE细胞中转染了miR-766-3p模拟物或抑制剂。结果表明，miR-766-3p模拟物显著抑制了HuCCT1细胞的增殖和迁移，而miR-766-3p抑制剂促进了RBE细胞ICC的进展。（图6h-i）。综上所述，miR-766-3p可以抑制ICC细胞的肿瘤发生。
在作者前期的研究中，miR-766-3p可以通过直接靶向SRSF1的来抑制肾细胞癌的进展。由此推测SRSF1也可能是ICC中miR-766-3p的下游基因。实验发现，转染miR-766-3p模拟物的HuCCT1细胞中SRSF1 mRNA和蛋白水平降低，而转染miR-766-3p抑制剂的RBE细胞中SRSF1细胞和蛋白水平升高（图6j-kh）。qRT-PCR实验发现，与正常组织相比，SRSF1在ICC组织中表达上调（图6l）。SRSF1的高表达是ICC患者的致癌因素之一（图6m）。此外，SRSF1表达与circPCNXL2表达呈正相关，而与miR-766-3p的表达呈负相关（图6n-o）。然后，双荧光素酶报告分析结果证实了SRSF1与miR-766-3p之间的相互作用（图6p）。
为了探讨SRSF1在ICC进展中的作用，作者HuCCT1和RBE细胞中对SRSF1进行过表达和敲除。克隆形成和transwell检测结果表明，过表达SRSF1显著促进了HuCCT1细胞的增殖和迁移。SRSF1敲低的RBE细胞中发现了相反的结果（图6q-r）。此外，SRSF1可以促进HuCCT1和RBE细胞中ERK的磷酸化，这可以通过过表达或下调circPCNXL2来逆转（图6s-t）。综上所述，circPCNXL2可通过miR- 766-3p/SRSF1/ERK通路调节ICC的增殖和迁移。
图6 CircPCNXL2通过海绵化miR-766-3p上调SRSF1的表达
CircPCNXL2作为一种潜在的治疗靶点，可减轻曲美替尼在体内的抗肿瘤作用
为了研究circPCNXL2对曲美替尼（MEK抑制剂）的影响，作者利用曲美替尼在体内抑制MEK/ERK通路，并利用过表达circPCNXL2的HuCCT1细胞建立皮下异种移植模型和肝转移模型。体内实验包括四组（Vector+DMSO、circicPCNXL2OE+DMSO、Vector+曲美替尼、circcPCNXL2 OE+曲美替尼）。在异种移植模型中，曲美替尼抑制肿瘤生长，而这种抑制作用被过表达circPCNXL2所逆转（图7a-c）。IHC染色显示，曲美替尼组的Ki-67和p-ERK染色最弱（图7d）。circPCNXL2的上调显著降低了曲美替尼在ICC中的抗肿瘤作用。在肝转移模型中也观察到类似的结果。曲美替尼治疗减少了肝转移灶的数量，而过表达circPCNXL2可减弱这种影响（图7e-f）。综上所述，circPCNXL2通过激活ERK磷酸化抑制曲美替尼在ICC的抗肿瘤疗效，这可能是一种有前途的ICC治疗策略。
图7 CircPCNXL2作为一个潜在的治疗靶点， 并减轻曲美替尼在体内的抗肿瘤作用
总结
本研究表明circPCNXL2在ICC中上调，并通过与STRAP相互作用促进ERK磷酸化，在ICC发展中发挥肿瘤启动子的作用。此外，circPCNXL2作为miR-766-3p的海绵，导致SRSF1的上调，从而进一步激活ICC中的MEK/ERK通路（图7g）。同时，circPCNXL2可以作为ICC患者的诊断和预后生物标志物。circPCNXL2-STRAP-MEK-ERK轴是研究ICC的一个很有前途的翻译治疗靶点。
原文链接
https://doi.org/10.1186/s12943-024-01950-y