一、“基因魔剪”如何施法？

——CRISPR/Cas系统原理

CRISPR/Cas系统，全称Clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated systems。在自然界中，CRISPR/Cas系统是一种原核生物天然免疫机制。CRISPR/Cas系统在原核生物中的作用机制如下：

适应：当原核生物适应性免疫系统受到外源核酸的影响，原核生物中Cas蛋白通过识别入侵核酸中的PAM位点（原间隔序列相邻基序），然后切割入侵核酸，将切割的入侵核酸整合到自身的CRISPR序列中（把外来入侵核酸部分序列记录到宿主基因组中）；

表达：当外源核酸再次入侵，原核生物启动CRISPR转录，形成初级转录产物pre-crRNA，pre-crRNA 与tracrRNA的部分序列配对形成双链RNA，再由核糖核酸酶或Cas蛋白切割形成成熟的crRNA；

干扰：成熟的tracrRNA-crRNA，与Cas蛋白结合形成RNA-Cas蛋白复合物，并引导crRNA-Cas蛋白复合物识别入侵核酸的PAM靶点，激活Cas内切酶活性，靶向切割目标DNA序列，从而干扰外源核酸的表达目的。[1]

图1. CRISPR-Cas免疫适应机制[1]

利用这种原理，以及被切断的双链DNA能激活细胞的非同源末端链接（NHEJ）或同源重组（HR）两种修复机制，就能实现基因的敲除、插入或修饰，从而达到基因编辑的目的。

二、“基因魔剪”长什么样儿？

——CRISPR/Cas9 结构

在不同种类的细菌和古细菌中，存在不同成分和机制的CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统主要分为两类，1类CRISPR-Cas系统效应蛋白复合物存在多个亚基，而2类通过单一的Cas蛋白发挥功能。CRISPR/Cas9系统来自酿脓链球菌 (Streptococcus pyogenes) ，属于2类CRISPR系统，是目前应用最广泛的基因组编辑工具。

CRISPR/Cas9系统由Cas9内切酶和sgRNA组成：

Cas9内切酶蛋白：含RuvC和HNH样核酸酶结构域，具有切割双链DNA的功能，能识别PAM基序（5’-NGG），并在PAM基序上游第3个碱基处切割双链DNA。

sgRNA：为tracrRNA和crRNA部分序列互补配对组成的复合物；其中tracrRNA负责与Cas9蛋白结合，而crRNA携带外来核酸识别序列（spacer）。基因编辑中，为了方便实验设计以及提高gRNA的稳定性，将tracrRNA和crRNA融合成一条RNA，称为sgRNA[2]。

图2. SpCas9蛋白、crRNA和tracrRNA复合物结合到dsDNA靶点的示意图[3]

三、“基因魔剪”魔法施向哪儿？

——CRISPR/Cas9 的应用

① 基因治疗：通过对病毒的定向基因编辑，可治疗感染性疾病；通过构建肿瘤模型、靶向敲除致癌基因位点、恢复抑癌基因活性、减少肿瘤细胞耐药性、激活肿瘤免疫等治疗肿瘤疾病；通过在突变位点处或附近切割DNA双链，同时诱导不同类型的插入，导致基因删除、突变、敲入、反转等，可治疗遗传疾病；利用基因编辑解决异种器官移植中的问题。

图3. CRISPR/Cas系统用于临床癌症治疗[4]

② 分子诊断：利用 Cas9高特异性识别并结合双链DNA(dsDNA)的特性，结合PCR技术可实现灵敏度更高、特异性和普适性更强的核酸分子检测。

③ 抗体生产：将动物免疫分子基因编辑为人类或异种基因，将解决异源抗体免疫排斥的问题。

④ 培育新品种：通过定向改造生物，实现农作物、畜牧家禽、水产品等新品种培育。

四、怎么锻造“基因魔剪”？

——CRISPR/Cas9系统的形式

在实际应用中，可通过细胞转染、腺相关病毒（AAV）、慢病毒等病毒包装，外泌体包装，LNPs包封等方式向胞内或体内或胞内递送质粒、Cas蛋白和sgRNA、mRNA和sgRNA、环状RNA（circRNA）和sgRNA等，从而在体内或胞内表达CRISPR/Cas9系统，达到基因编辑的目的。

图4. CRISPR/Cas系统递送方式[4]

图5. CRISPR/Cas系统表达形式，包括编码gRNA和Cas蛋白的质粒，Cas mRNA或circRNA混合物和gRNA，以及Cas蛋白与gRNA的复合物

各种形式各有优缺点，circRNA的表达形式是其中最优前景和发展潜力的。

① 质粒

优点：相对稳定，成本低，易于制造；

缺点：转染和表达效率低；整合到基因组的风险大；Cas蛋白较大，导致质粒碱基数多，更增加了病毒包装难度。

② Cas蛋白和sgRNA复合物

优点：方法相对直接，起效快；

缺点：复合物降解速度快；蛋白较大且RNPs复合物电荷特性使递送效率低；较纯的活性Cas蛋白耗时长、成本高，还涉及细菌内毒素污染问题。

③ mRNA和sgRNA

优点：获取较易，可通过体外转录得到；与质粒相比起效更快；脱靶概率更低；免疫原性较低；胞内存留时间短，安全性更高；

缺点：mRNA不稳定，很容易降解。

④ 环状RNA（circRNA）和sgRNA

优点：与质粒相比起效更快，脱靶效率低，获取较易，安全性更高，可体外制备得到（具备线性mRNA的所有优点）；与线性mRNA相比，circRNA的环状结构使其稳定性更高，半衰期更长。线性RNA的免疫原性可能干扰蛋白的产生，并触发清除编辑细胞的免疫反应。因此，免疫原性更低的circRNA是基因编辑元件更合适的介质。因此，circRNA在基因编辑中具有重要的应用前景。

缺点：目前对RNA疗法的应用开发主要集中在线性mRNA，circRNA应用的开发研究仍然较少，还只是停留在概念层面，研究者对circRNA的翻译能力和体外制备仍持保留意见。

然而，吉赛生物掌握独立自主知识产权的环状RNA体外制备技术，能实现circRNA的规模量产，得到的circRNA纯度高、完整性高、翻译能力强，解决了circRNA的规模化生产和翻译效率的问题。而且，吉赛生物具备circRNA-LNP包封技术，新一代LNP递送技术具有更高的载量，能递送大片段的circRNA序列，同时具备更好的免疫激活特性和安全性。

依托10多年circRNA领域的专注研发及创新探索，吉赛生物已建成circRNA原液生产体系，可提供报告基因、肿瘤抗原、抗肿瘤、生长因子、免疫治疗、基因编辑、蛋白/抗体替代、iPSC重编程、抗衰老、神经营养因子、神经再生转化因子、天然环状RNA等多个系列的预制circRNA现货产品。针对CRISPR/Cas9系统，推出circRNA现货产品GSPure® Circ-Cas9，助力研究者们手握高效的“基因魔剪”，以“上帝视角”，剪出高分paper！

吉赛生物circRNA现货产品性能

① 吉赛生物GSPure® Circ-Cas9标准品制备环化率＞90%，纯度达99.7%，完整性达94%，能高效表达Cas9蛋白。

图6. GSPure® Circ-Cas9标准品环化率检测结果（A），HPLC纯化后纯度检测（B），Agilent 2100检测完整性结果（C），WB实验检测Cas9蛋白的表达（D）。

② 吉赛生物circRNA现货产品完整性高，Agilent 2100检测显示无杂峰，完整性为90%以上。

图7. Agilent 2100检测circRNA现货产品完整性

③ 吉赛生物circRNA现货产品纯度高，HPLC检测显示纯度为90%以上。

图8. HPLC检测circRNA现货产品纯度

④ 吉赛生物circRNA现货产品翻译效率高

GSPure® Circ-eGFP和GSPure® Circ-mCherry分别转染293T细胞，在多个时间点于荧光显微镜下观察荧光，可见荧光信号强且稳定，蛋白翻译表达水平优于线性mRNA。

图9. GSPure® Circ-eGFP转染293T细胞后荧光检测结果（放大倍数：100×）

图10. GSPure® Circ-mCherry转染293T细胞后荧光检测结果（放大倍数：100×）

肌肉注射LNP包封 Circ-Fluc至Bal/bc小鼠，通过体内验证、筛选不同IRES序列、优化密码子序列，提高circRNA翻译效率，满足不同药物开发的需求。

图11. 肌肉注射LNP包封的Circ-Fluc至Bal/bc小鼠，6h后活体荧光检测结果（Circ-Fluc经最佳密码子序列优化，且含不同IRES序列）。

⑤ 吉赛生物circRNA现货产品翻译产物活性高，GSPure® Circ-Fluc转染293T细胞，48h/72h后检测荧光素酶活性，结果可见吉赛生物GSPure® Circ-Fluc荧光素酶活性明显高于mRNA产品表达的荧光素酶。

图12. circRNA现货产品表达的荧光酶活性检测

[1] Watson BNJ, Steens JA, Staals RHJ, Westra ER, van Houte S. Coevolution between bacterial CRISPR-Cas systems and their bacteriophages. Cell Host Microbe, 2021, 29(5):715-725.

[2] Janik E, Niemcewicz M, Ceremuga M, et al. Various Aspects of a Gene Editing System-CRISPR-Cas9. Int J Mol Sci. 2020 Dec 16;21(24):9604.

[3] Rozners E. Chemical Modifications of CRISPR RNAs to Improve Gene-Editing Activity and Specificity. J Am Chem Soc, 2022, 144(28):12584-12594.

[4] Li Y, Zhou S, Wu Q, Gong C. CRISPR/Cas gene editing and delivery systems for cancer therapy. WIREs Nanomed Nanobiotechnol, 2024, 16:e1938.