“下一代RNA疫苗”大门的关键之钥——RNase R

RNase R简介

Ribonuclease（RNase R）最初在大肠杆菌中发现，来源于大肠杆菌RNR超家族，有两个冷休克结构域，一个RNase催化结构域，一个S1结构域和一个基本结构域。RNase R是一种3’-5’核糖核酸外切酶，可从3’-5’方向将RNA逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R可消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化环状RNA、套索结构或3’突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子。

细胞中过量的RNase R充当有害的细菌蛋白，因为RNase R比其他细菌外核糖核酸酶(如RNase II)更活跃，更有效地降解RNA（甚至是具有二级结构的RNA）。但RNase R作为工具酶，在circRNA的体外研究和制备中具有关键的作用。

RNase R的应用

随着mRNA药物研究的逐步深入，circRNA以其结构稳定、免疫源性较低、翻译能力较强等优势在疫苗和新疗法开发的潜力得到关注，被认为是下一代RNA疫苗。研究circRNA的机制、功能和应用，通常需要对circRNA进行鉴定、富集和纯化等，过程中广泛应用RNase R。

① circRNA鉴定

使用RNase处理RNA目标产物，结合RT-PCR或Northern Blot实验，检测RNase R(+)和RNase R(-)组中是否有条带，从而证验证目标分子是否为circRNA。

RNase R消化后RT-PCR检测Lariat/Circular RNA。检测的mRNA在RNase R(-)组中有条带，在RNase R(+)组中无条带；检测的Lariat/Circular RNA在RNase R(-)和RNase R(+)样品中都有条带。结果表明mRNA被消化，而Lariat/Circular RNA耐受消化（Suzuki H et al., 2006）。

② circRNA富集

针对circRNA进行高通量测序时，常需要进行circRNA富集，为探究RNase R消化后circRNA的富集程度和相关基因的变化，可以同时做RNase R(+)和RNase R(-)组样品的测序。

③ circRNA纯化

circRNA产物相关杂质（副产物）包括：线性的circRNA前体、circRNA的开环异构体nicked RNA、dsRNA；另外Ⅰ型内含子自剪切（PIE）环化会产生游离的内含子片段，而借助夹板的酶法连接会产生夹板片段等。

circRNA体外合成过程产生的这些线性RNA杂质，可能会被体内模式识别受体（PRR）识别为强免疫原，引发先天性免疫反应。因此，去除相关杂质、制备高纯度circRNA的有效纯化方法或工具，是circRNA新疫苗或疗法的开发中先要的也是必要的。

高效的RNase R可以消除线性RNA残余的干扰，是人工合成高纯度circRNA的关键，也可应用于环化产物的质检。

 

RNase R的提产与增效

CircRNA被各大生物医药公司列入极具研究潜能的RNA疫苗候选形式，RNase R也成为circRNA规模化制备及纯化的重要原料之一。为此，RNase R的高效量产是必然需求。此外，RNase R反应体系一般要求较低的NaCl浓度，当NaCl浓度＞100mM时，RNase R活性会被明显抑制。这样的条件限制对RNA样本纯度提出了更高的要求，也增加了RNA制备成本和损失量。

吉赛生物具有原创的环状专利技术，其circRNA制备技术（circPure®和circPrecise®）处于领先水平。RNase R作为circRNA体外制备的必要原料，也成为了吉赛生物的技术突破对象。吉赛生物是国内最早批开发并优化RNase R制备技术的企业。针对RNase R优化的研究仍较少，为推动circRNA研究及应用，吉赛生物对RNase R氨基酸序列做出了优化（专利号：CN202210108730.8），自主研发了突变型RNase R_△M8，其表达产量相对于野生型提高了近18%。RNase R产量的提高有利于其高效的规模化制备，RNase R_△M8具有良好的工业化前景，为circRNA新疫苗或药物的制备和研发打下了坚实的基础。

1) RNase R_WT诱导前细胞裂解液；2) RNase R_WT经过IPTG诱导后细胞裂解液；3) 经过Ni-NTA柱纯化后的RNaseR_WT蛋白；4) RNase R_△M8诱导前细胞裂解液；5) RNase R_△M8经过IPTG诱导后细胞裂解液；6) 经过Ni-NTA 柱纯化后的RNase R_△M8蛋白。

突变型RNase R（RNase R_△M8）的序列优化参考了耐盐的嗜冷杆菌（Psychrobacter sp.）菌株ANT206来源的RNase R氨基酸序列。对比野生型RNase R，突变型RNase R_△M8耐盐和消化能力更强（能耐受终浓度为150mM的NaCl），有利于满足多样化RNA样本的需求。

野生型RNase R(RNase R_WT)和突变型RNase R(RNase R_△M8)对末端完全双链结构的RNA2基本不消化，可以消化3’有突出结构的RNA1。

此外，吉赛生物RNase R（GSPure® RNase R）特异性强、效率高且使用方便，综合性能与同类型产品相比具有较强的竞争力，引用文献500篇以上，得到众多研究人员的肯定。

 

吉赛生物GSPure®RNase R产品列表

 

吉赛生物GSPure®RNase R性能

① 针对线性RNA的消化能力强

将10U RNase R加入到2.5 μg Total RNA中，于37℃孵育15 min后直接进行电泳检测，结果显示RNase R(+)组条带变淡（不可见），表明RNase R对Total RNA产生消化作用。吉赛和公司A或公司E的RNase R对Total RNA消化效果相当。

将10U RNase R加入到2.5 μg total RNA中，于37℃孵育30 min后进行RT-qPCR实验，结果显示RNase R+组β-actin和FGFR2的丰度都明显降低，表明RNase R可消化线性RNA。吉赛和公司E的RNase R对线性RNA消化效果相当，优于公司A的RNase R。

② 特异性强，对circRNA的影响较小

吉赛生物circPrecise® 平台体外合成环状RNA产物耐受RNase R切割，RNase R处理后环化产物量损耗极少。

将10U RNase R加入到2.5 μg total RNA中，于37℃孵育30 min后进行RT-qPCR实验，结果显示RNase R+ 组中hsa_circFOXO3_002和hsa_circMTO1_001的丰度基本不变，表明circRNA耐受RNase R的消化。吉赛和公司E或公司A的RNase R效果相当。

注：数据计算以“RNase R+吉赛”组为对照，设定其相对丰度值为1。

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