腹腔内扩散是上皮性卵巢癌（EOC）转移的主要方式，其预后差，复发率高，临床亟需有效治疗EOC转移的新靶点。铁死亡是一种由铁依赖的磷脂过氧化引起的新型程序性细胞死亡，在癌症研究的早期阶段就被发现与癌症密切相关。铁死亡的两个主要分子机制包括脂质过氧化和典型的GPX4调节的铁死亡途径，而脂质过氧化物(LPOs)的积累是铁死亡的标志。目前Tau蛋白与铁死亡的关系成为了研究热点，尽管在神经退行性疾病中已经阐明了Tau和铁死亡的关系，但在癌症中仍然缺乏相关的研究。因此揭示EOC中Tau和铁死亡的关系可为EOC的诊断和治疗提供理论基础。
2024年4月18日，昆明医科大学第三附属医院王绍佳副主任医师、复旦大学附属肿瘤医院肿瘤研究所邵杨助理研究员及上海大学生命科学学院李艳利副教授在Advanced Science（IF=15.1）杂志上共同通讯发表论文“Tau Aggregation-Dependent Lipid Peroxide Accumulation Driven by the
hsa_circ_0001546/14-3-3/CAMK2D/Tau Complex Inhibits Epithelial Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis”。该研究发现了一种在EOC中低表达的hsa_circ_0001546，它通过直接结合14-3-3形成hsa_circ_0001546/14-3-3复合体，进一步募集激酶CAMK2D，诱导Tau蛋白Ser324位点的异常磷酸化，从而导致Tau蛋白聚集依赖的LPO积累和铁死亡，最终阻止EOC的进展。本研究揭示了hsa_circ_0001546通过影响脂质过氧化依赖性铁死亡抑制EOC转移的新机制，并强调了hsa_circ_0001546作为EOC转移生物标志物和治疗靶点的重要性。
亮点
1. hsa_circ_0001546是EOC患者转移和预后的重要生物标志物。
2. hsa_circ_0001546作为伴侣分子可直接与14-3-3蛋白结合形成复合体，并招募CAMK2D诱导Tau蛋白Ser324的磷酸化，最终形成
hsa_circ_0001546/14-3-3/CAMK2D/Tau复合体。
3.
hsa_circ_0001546/14-3-3/CAMK2D/Tau复合体的存在刺激Tau蛋白聚集的产生，进而诱导LPOs的积累，导致LPO依赖的铁死亡。
1. hsa_circ_0001546在配对的卵巢癌原位灶、大网膜转移灶和腹膜转移灶中的表达逐渐下调
研究团队对8例正常卵巢组织和10例卵巢癌组织进行circRNA-Seq测序分析并验证发现hsa_circ_0001546在卵巢癌中低表达。利用hsa_circ_0001546的特异性探针对卵巢癌患者的组织切片进行了原位杂交实验，实验结果显示，与正常卵巢组织相比，hsa_circ_0001546在卵巢癌原发灶、大网膜转移灶和腹膜转移灶中表现出较低的阳性率。结果表明hsa_circ_0001546与卵巢癌的恶性程度呈负相关。
2. hsa_circ_0001546主要定位于细胞质，在体外抑制卵巢癌的进展
在体外实验中，研究团队在HEY及SKOV3细胞系中构建了hsa_circ_0001546过表达和敲低的稳转细胞系。通过CCK-8、克隆形成、划痕和Transwell实验证明了hsa_circ_0001546在卵巢癌中发挥抑癌基因的功能。
3. hsa_circ_0001546与卵巢癌细胞中14-3-3蛋白具有直接相互作用
为了探讨hsa_circ_0001546调控卵巢癌进展的分子机制，研究团队通过RNA pull-down和RIP实验证明了hsa_circ_0001546能够与14-3-3蛋白结合。为了研究hsa_circ_0001546与14-3-3蛋白的结合位点，研究团队通过catRAPID数据库进行预测，将质谱检测出的四种14-3-3蛋白家族成员的序列分别与circ_0001546的序列匹配并进行同源性分析，以质谱检测结果中丰度最高的YWHAH蛋白序列为模板构建pCDNA3.1-Flag质粒，通过RIP实验初步判断hsa_circ_0001546与YWHAH蛋白的第165-186aa区域结合。为了进一步验证上述结果，研究团队通过DNASTAR软件分析蛋白二级结构，避开潜在的功能结构域，构建了带有3×Flag标签的全长和截短序列的质粒，通过RIP实验证明hsa_circ_0001546与14-3-3蛋白家族成员YWHAH蛋白的第165-186aa区域结合。
4. hsa_circ_0001546/14-3-3蛋白通过招募CAMK2D促进Tau磷酸化和诱导Tau聚集
研究团队发现hsa_circ_0001546能促进Tau的Ser324和Ser214位点的磷酸化水平，并通过Co-IP、FISH及IF实验证明hsa_circ_0001546促进与14-3-3蛋白结合的Tau蛋白从非磷酸化转向磷酸化。利用Co-IP及PLA实验证实hsa_circ_0001546过表达能够驱动14-3-3与CAMK2D的直接结合，从而诱导Tau蛋白的异常磷酸化。研究团队通过CHX实验证明上调hsa_circ_0001546可以提高14-3-3蛋白的半衰期，并且伴随着p-Tau (S324)蛋白半衰期的提高。最后通过IF实验及以上结果证明hsa_circ_0001546通过促进14-3-3介导的CAMK2D的募集而促进Tau磷酸化，从而使14-3-3结合的Tau从非磷酸化变为磷酸化(Ser324)，导致Tau聚集性增加，最终抑制卵巢癌的增殖和转移。
5.hsa_circ_0001546/14-3-3/CAMK2D/p-Tau复合体促进卵巢癌脂质过氧化依赖的铁死亡
研究团队利用脂质过氧化物的探针Liperfluo对hsa_circ_0001546过表达稳转细胞系内的脂质过氧化物的积累情况进行检测，发现hsa_circ_0001546促进卵巢癌细胞系中脂质过氧化物的产生。通过检测GPX4蛋白的表达和线粒体形态变化再次证明hsa_circ_0001546对铁死亡具有促进作用。为了探讨hsa_circ_0001546在铁死亡中的作用机制，研究团队分别用ferrostatin-1和TRx0237处理稳定过表达hsa_circ_0001546的卵巢癌细胞，发现
hsa_circ_0001546/14-3-3/CAMK2D/p-tau复合体诱导的铁死亡依赖于脂质过氧化而不是依赖于GPX4。为了进一步探讨hsa_circ_0001546对卵巢癌细胞铁死亡的促进作用是否受Tau磷酸化的影响，研究团队用TRx0237处理稳定过表达hsa_circ_0001546的卵巢癌细胞，最后证明
hsa_circ_0001546/14-3-3/CAMK2D/p-Tau复合体通过促进Tau的磷酸化导致Tau聚集，从而导致脂质过氧化物聚集，最终导致铁死亡。
6. hsa_circ_0001546/14-3-3通过介导Tau磷酸化抑制体内卵巢癌进展
在体内实验中，研究团队通过皮下移植瘤和腹腔转移瘤模型证明hsa_circ_0001546抑制卵巢癌的增长和转移。并通过免疫组化实验发现hsa_circ_0001546过表达组的裸鼠瘤体中，14-3-3蛋白和Tau蛋白的表达量没有明显差异，而p-Tau(S324)蛋白和p-Tau(S214)蛋白的表达量呈明显上升的趋势。
7.hsa_circ_0001546/14-3-3/CAMK2D/p-Tau复合体通过诱导脂质过氧化依赖性铁死亡抑制卵巢癌的体内扩散
研究团队建立了裸鼠腹腔转移模型并利用ferrostatin-1和TRx0237给小鼠注射或口服治疗，小动物活体成像显示，与生理盐水组相比，ferrostatin-1和TRx0237均可阻断hsa_circ_0001546对卵巢癌体内扩散的抑制作用，并引起更明显的腹膜种植转移。该结果证明
hsa_circ_0001546/14-3-3/CAMK2D/p-Tau复合体通过诱导铁死亡抑制卵巢癌的转移。研究团队通过免疫组化和荧光原位杂交实验对临床样本进行检测，发现p-Tau(S324)和p-Tau(S214)在配对的卵巢癌原位灶、大网膜转移灶和腹膜转移灶中的表达显著降低，与前期研究结果一致。
总结
该研究为
hsa_circ_0001546/14-3-3/CAMK2D/Tau复合物的存在提供了新的证据，Tau蛋白聚集导致的铁死亡不仅存在于阿尔茨海默病或帕金森病等神经退行性疾病相关细胞中，还发生在卵巢癌细胞中，并且这种由hsa_circ_0001546/14-3-3/CAMK2D/Tau复合物驱动的铁死亡是脂质过氧化依赖性的，而不是GPX4依赖性的。本研究通过一系列探索从铁死亡角度探究了hsa_circ_0001546的功能，为卵巢癌转移提供了一个有前景的预后生物标志物和治疗靶点。
上海大学硕士研究生柴彬淑（现浙江大学药学院博士研究生在读），复旦大学附属肿瘤医院主治医师吴勇和昆明医科大学第三附属医院硕士研究生杨恒慧为共同第一作者。