膀胱癌（BCa）是泌尿系统常见的恶性肿瘤，浸润性膀胱癌患者的预后较差。多形核骨髓源性抑制细胞（PMN-MDSCs）是一种具有免疫抑制功能较强的病理激活免疫细胞，可在许多疾病中出现。PMN-MDSCs浸润肿瘤微环境是肿瘤进展和免疫治疗效果差的主要因素之一，其存在与预后不良显著相关。受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）和脂肪酸转运体2（FATP2）是调节MDSCs 免疫抑制功能的重要分子。PMN-MDSCs的浸润与FATP2的表达呈正相关，与RIPK3的表达呈负相关。然而，PMN-MDSCs在肿瘤微环境中同时上调FATP2和下调RIPK3介导的抑制性免疫的机制尚不清楚。circRNA在调节各种人类恶性肿瘤的肿瘤增殖和转移中起着至关重要的作用。因此，本研究的目的是阐明在PMNMDSCs中上调FATP2表达和下调RIPK3表达的潜在分子机制，以及circRNA在其中发挥的作用，并为癌症免疫治疗提供新的思路。
2024年3月9日，南方医科大学南方医院泌尿外科谭万龙教授团队研究发现在Molecular Cancer（IF=37.3）发表文章：Bladder-cancer-derived exosomal circRNA_0013936 promotes suppressive immunity by up-regulating fatty acid transporter protein 2 and down-regulating receptor-interacting protein kinase 3 in PMNMDSCs。本研究表明在PMN-MDSCs中，BCa来源的外泌体circRNA_0013936通过
circRNA_0013936/miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过circRNA_0013936/ miR-301b-3p/CREB1通路下调RIPK3，从而促进抑制性免疫。这些发现有助于为人类膀胱癌的临床治疗找到新的靶点。
PMN-MDSCs浸润性膀胱肿瘤组织中FATP2和RIPK3的表达
作者采用免疫荧光法检测肿瘤组织中PMN-MDSCs的浸润情况。双阳性细胞（CD11b+/LOX-1+）被标记为PMN-MDSCs。免疫组化显示FATP2和RIPK3的表达。图1A显示肿瘤组织中存在大量的PMN-MDSCs。肿瘤组织中FATP2的表达显著上调，而RIPK3的表达显著下调（图1B-C）。统计分析结果显示，膀胱肿瘤组织中PMN-MDSCs的浸润与FATP2的表达呈正相关，与RIPK3的表达呈负相关（图1D-E）。免疫组化结果显示，LOX-1和FATP2在人膀胱肿瘤组织中的表达高于癌旁组织，而RIPK3的表达低于癌旁组织（图1F）。此外，与I/II期患者相比，III/IV期患者在肿瘤组织中FATP2高表达，RIPK3低表达（图1G）。
图1 PMN-MDSCs浸润肿瘤微环境，过表达FATP2，低表达RIPK3
BCa衍生的外泌体上调PMN-MDSCs中的FATP2，下调RIPK3
透射电镜显示，BCa衍生的外泌体具有完整的、连续的双层膜，这是外泌体的典型形态学特征（图2A）。与PMN-MDSCs共培养后，用荧光PKH67标记的BCa衍生的外泌体被PMN-MDSCs内化（图2B）。当PMN-MDSCs与BCa来源的外泌体共培养时，PMN-MDSCs中FATP2的表达显著上调，而RIPK3的表达显著下调（图2C-D）。LC-MS分析显示，BCa衍生的外泌体促进了PMN-MDSCs中脂质代谢分子（PGE2、TG、AA）的合成（图2E）。此外，ELISA分析显示，BCa衍生的外泌体促进了PMN-MDSCs中免疫抑制分子（IL-10、iNOS、Arg-1）的合成（图2F）。
图2 BCa衍生的外泌体上调PMN-MDSCs中的FATP2，下调RIPK3
circRNA_0013936在BCa衍生的外泌体中的鉴定和表征
作者采用高通量测序来鉴定BCa衍生的外泌体中差异表达的环状RNA。其中，环状RNA表达上调比下调的环状RNA更普遍（图3A）。作者选择了10个上调最多的环状RNA。根据RNA测序和qRT-PCR结果，hsa_circ_0013936是表达差异最大的上调的circRNA（补充图2C）。图3B显示了circRNA_0013936的形成。qRT-PCR显示，与正常尿路上皮细胞来源的外泌体相比，三种BCa细胞来源的外泌体中circRNA_0013936的表达显著上调（图3C）。此外，作者还设计了聚合引物和发散引物来扩增circRNA_0013936。以UMUC3和T24细胞系的cDNA和gDNA（基因组DNA）为模板，仅在cDNA中使用发散引物扩增到circRNA_0013936，gDNA中未见扩增产物（图3D）。通过qRT-PCR，作者进一步证实了circRNA_0013936对RNase R具有耐受性（图3E）。FISH分析显示，circRNA_ 0013936主要位于膀胱肿瘤细胞的细胞质中（图3F）。
图3 circRNA_0013936的鉴定和表征
CircRNA_ 0013936在PMN-MDSCs中上调FATP2，下调RIPK3
为了证实circRNA_0013936可以在PMN-MDSCs中上调FATP2的表达，下调RIPK3的表达，作者用circRNA_0013936模拟物转染了PMN-MDSCs。Western blot结果显示，circRNA_0013936模拟物显著上调了PMNMDSCs中FATP2的表达，下调了RIPK3的表达（图4A-B）。ELISA分析显示，circRNA_0013936模拟物促进了PMN-MDSCs中免疫抑制细胞因子（Arg-1、IL-10、iNOS）的合成（图4C）。LC-MS分析显示，circRNA_0013936模拟物增加了PMN-MDSCs中脂质代谢分子（AA、TG、PGE2）的水平（图4D）。
图4 CircRNA_ 0013936在PMN-MDSCs中上调FATP2，下调RIPK3
CircRNA_ 0013936可以作为miR-320a和miR-301b-3p的海绵
为了研究circRNA_0013936是否可以在PMN-MDSCs中海绵化miRNA，作者通过CircInteractome数据库以及荧光素酶报告基因分析实验，发现了3个候选miRNA（图5A）。然后使用生物素化circRNA探针下拉PMN-MDSCs中的circRNA_0013936（图5B）。RIP实验发现circRNA_0013936、miR-320a和miR- 301b-3p特异性富集，表明miR-320a和miR- 301b-3p是PMN-MDSCs中与circRNA_0013936相关的miRNA（图5C）。图5D显示了miR-320a和miR-301b-3p在PMN-MDSCs中的基本表达情况。为了进一步证实miR-320a和miR-301b-3p是否能与circRNA_0013936结合，作者在293T细胞中进行了双荧光素酶报告实验。结果显示，miR-320a和miR-301b-3p mimic均显著降低了WT-circRNA_0013936的荧光素酶活性（图5E-G）。这些结果表明，circRNA_0013936可作为miR- 320a和miR-301b-3p的海绵发挥作用。
图5 CircRNA_ 0013936可作为miR-320a和miR-301b-3p的海绵
JAK2是miR-320a的直接靶基因，而CREB1是miR-301b-3p的直接靶基因
为了进一步探索其潜在机制，作者利用Targetscan、miRDB、DIANA-microT和Starbase预测miR-320a和miR-301b-3p的靶基因。此外，作者通过RNA测序分析了PMN-MDSCs（circ_0013936-sh vs. circ_0013936-nc）中的差异基因表达。根据RNA测序结果和对靶基因的预测，作者发现miR-320a和miR-301b-3p的下游靶基因分别有9个基因和7个基因（图6A和G）。然后，通过qRT-PCR来验证候选基因。在含有miR-320a保守结合位点的基因中，JAK2在PMN-MDSC-lv-circ_0013936中上调，在PMN-MDSC-sh-circ_0013936中下调（图6B）。在含有miR-301b-3p保守结合位点的基因中，CREB1在PMN-MDSC-lv-circ_0013936中上调，在PMN-MDSC-sh-circ_0013936中下调（图6H）。
此外，双荧光素酶报告基因检测显示，miR-320a模拟物显著降低了JAK2野生型的活性，但没有降低JAK2突变体的活性（图6C-D），miR-301b-3p模拟物显著降低了CREB1野生型的活性，但没有降低CREB1突变体的活性（图6J-K）。此外，如图6J-K和L-M所示，在转染miR-320a/miR-301b-3p模拟物或miR-320a/miR-301b-3p抑制剂的PMN-MDSCs中，JAK2和CREB1的表达在mRNA和蛋白水平上均显著上调或下调。
图6 JAK2是miR-320a的直接靶基因，而CREB1是miR-301b-3p的直接靶基因
CircRNA_0013936通过
circ_0013936/miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过circ_0013936/ miR-301b-3p/ CREB1通路下调RIPK3
CircRNA_0013936通过促进PMN-MDSCs中JAK2的表达来增加FATP2的表达，这一作用可被miR-320a模拟物逆转。circRNA_0013936的敲低通过降低JAK2的表达来抑制FATP2的表达，而miR-320a抑制剂可以逆转此现象（图7A-C）。CircRNA_0013936通过增加CREB1的表达来抑制PMN-MDSCs中RIPK3的表达，这一作用可被miR-301b-3p模拟物逆转。相反，敲低CircRNA_0013936会通过降低CREB1的表达促进RIPK3的表达，而miR-301b-3p抑制剂可逆转这一现象（图7H-J）。qRT-PCR和Western blot分析结果显示，敲低JAK2或CREB1可显著下调FATP2的表达或上调RIPK3的表达，并这一现象可通过过表达JAK2或CREB1来逆转（图7D-F和K-M）。CircRNA_0013936促进了PMN-MDSCs衍生的细胞因子（Arg-1、IL-10、iNOS、AA、TG、PGE2）的产生，这一作用可被miR-320a或miR-301b-3p模拟物逆转。而敲低circRNA_0013936则抑制了PMN-MDSCs衍生的细胞因子的产生，这可被miR-320a或miR-301b-3p抑制剂所逆转（图7G和N）。综上所述，circRNA_0013936通过海绵化miR-320a和miR-301b-3p来调控FATP2和RIPK3的表达。
图7 CircRNA_0013936通过miR-320a/JAK2和miR-301b-3p/CREB1通路上调FATP2和下调RIPK3
在PMN-MDSCs中，外泌体circRNA_0013936通过
circ_0013936/miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过circ_0013936/ miR-301b-3p/ CREB1通路下调RIPK3，从而促进抑制性免疫
为了研究BCa衍生的外泌体circRNA_0013936是否通过miR-320a/JAK2和miR- 301b-3p/CREB1通路调控PMN-MDSCs中FATP2和RIPK3的表达，作者使用CRISPR-Cas9基因组编辑系统生成了circRNA_0013936敲除膀胱癌细胞。然后，作者检测了与BCa-外泌体或circRNA_0013936-KO-Bca-外泌体共培养的PMN-MDSCs中FATP2和RIPK3的表达。图8A-B，BCa衍生的外泌体circRNA_0013936海绵化miR-320a，通过激活JAK2/pSTAT5通路促进FATP2的表达，而circRNA_0013936-KO-外泌体则表现出相反的作用。同时，BCa衍生的外泌体circRNA_0013936海绵化miR-301b-3p，然后通过激活CREB1通路抑制RIPK3的表达，而circRNA_0013936-KO-外泌体则表现出相反的作用（图8D-E）。最终，BCa衍生的外泌体circRNA_0013936促进了PMN-MDSCs的免疫抑制细胞因子的产生（图8C，F）。
为了研究BCa来源的外泌体circRNA_0013936是否通过调节PMN-MDSCs中的FATP2和RIPK3来影响CD8+ T细胞的功能，作者将CD8+ T细胞与BCa来源的外泌体或circRNA_0013936-KO-BCa-外泌体诱导的PMN-MDSCs共培养。流式细胞术和CFSE分析结果显示，BCa来源的外泌体通过调节FATP2和RIPK3的表达，显著抑制了IFN-γ的产生和CD8+ T细胞的增殖功能，而circRNA_0013936-KO-BCa-外泌体则表现出相反的作用（图8G-H）
图8 在PMN-MDSCs中，外泌体circRNA_0013936通过miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过miR-301b-3p/CREB1通路下调RIPK3，从而促进抑制性免疫
小结
在BCa衍生的外泌体中富集的CircRNA_0013936可以促进FATP2的表达，并抑制PMN-MDSCs中RIPK3的表达。在机制上，circRNA_0013936通过海绵化miR-320a和miR-301b促进RIPK2的表达，而miR-301b分别直接靶向JAK2和CREB1，抑制RIPK3的表达。最终，circRNA_0013936在PMN-MDSCs中，通过
circRNA_0013936/miR-320a/JAK2通路上调FATP2，通过circRNA_0013936/miR-301b/CREB1通路下调RIPK3，显著抑制CD8+ T细胞的功能。结果表明，circRNA_0013936有望成为BCa的有效治疗靶点。这些发现为膀胱癌的临床治疗提供了理论基础和新的思路。