胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)是具有侵袭性和致命性的恶性肿瘤之一，已成为癌症相关死亡的第四大原因，在过去的几十年间对PDAC的分子机制和治疗方法的研究取得了进展，但它的5年生存率仍是所有恶性肿瘤中最低的[1]。同时在PDAC中发育进程中发现癌基因的诱导表达可导致DNA损伤，进而影响基因组的稳定甚至细胞凋亡[2]。circSMARCA5可以在亲本基因位点结合，导致亲本基因SMARCA5在外显子15处转录暂停以降低其表达，从而抑制乳腺癌（BC）中SMARCA5介导的DNA损伤修复和顺铂耐药[3]。circMBOAT2通过miR-433-3p/GOT1轴促进PDAC细胞的增殖、转移和谷氨酰胺代谢[4]。但是有关circRNA对PDAC中DNA损伤调控的研究尚未见报道。
2023年12月4日，徐州医科大学附属医院普外科任泽强/张蓬波团队在Molecular Cancer（IF=37.3）发表文章hsa_circ_0007919 induces LIG1 transcription by binding to FOXA1/TET1 to enhance the DNA damage response and promote gemcitabine resistance in pancreatic ductal adenocarcinoma。结果显示，作者在胰腺导管腺癌预后较差的患者中鉴定到了高表达的hsa_circ_00007919，并以一种依赖LIG1的表达来抑制GEM诱导的DNA损伤、DNA的断裂积累和细胞凋亡来维持细胞的存活以提高对GEM的耐药性，揭示了hsa_circ_0007919为治疗PDAC提供了新的潜在靶点。
一、hsa_circ_0007919在GEM耐药PDAC中表达上调，预测预后不良
作者通过NGS测序对三对GEM耐药/敏感的PDAC组织中检测了特异表达的circRNA，共筛选了62个差异表达的circRNA（FC<-1 或 FC>1, P<0.05）,其中hsa_circ_0007919在GEM耐药的PDAC组织中显著上调。随后通过对耐药/敏感组织的qPCR/sanger测序/背靠背特异性验证/R酶消化进一步验证了它是环状表达的。同时通过总生存期（overall survival, OS）及无病生存期（disease-free survival，DFS）的关系分析表明，hsa_circ_0007919高表达预示OS和DFS较差，同时对接受GEM治疗的PDAC患者中发现，hsa_circ_0007919高表达与OS和DFS较差呈正相关关系。
图1. 高通量测序鉴定GEM耐药的PDAC中相关的circRNA
二、hsa_circ_0007919抑制DNA损伤和吉西他滨敏感性
作者通过对GEM耐药的PDAC组织中鉴定到了hsa_circ_0007919上调，进一步研究了hsa_circ_0007919其在GEM耐药细胞中的功能。首先通过干扰/GEM抗性细胞系筛选实验发现抑制hsa_circ_0007919的表达增加了细胞对GEM的敏感性，且在GEM抗性细胞系中高表达。并进一步通过敲低/过表达/CCK8/流式/DNA Ladder实验实验表明hsa_circ_0007919下调/上调分别降低/增高了细胞增殖并增加/降低了细胞凋亡。与细胞凋亡的检测结果一致的是：hsa_circ_0007919下调/上调分别增加/降低半胱氨酸蛋白酶3和9cleaved caspase 3和cleaved caspase 9及降低/增加了BCL2的表达。
图2. hsa_circ_0007919抑制GEM耐药PDAC细胞的吉西他滨敏感性和凋亡
同时作者进一步评估了hsa_circ_0007919对DNA损伤的影响，hsa_circ_0007919下调/上调分别增加/减少了单细胞凝胶电泳中出现拖尾现象及增加/降低了H2AX的磷酸化（γH2AX）的荧光强度，表明DNA出现损伤。进一步利用小鼠的异种移植模型，发现hsa_circ_0007919沉默的PANC-1/GEM和CFPAC-1/GEM细胞所形成的肿瘤体积和重量均小于对照组。并通过IHC/TUNEL assay/qPCR检测发现hsa_circ_0007919沉默可降低Ki-67的表达，并增加caspase 3和γH2AX的表达及促进细胞凋亡。这些结果表明，hsa_circ_0007919可通过减少DNA损伤，促进细胞增殖及减少细胞凋亡，从而增强细胞对GEM的抗性。
图3. hsa_circ_0007919抑制GEM耐药细胞DNA损伤及促进体内肿瘤增殖
三、hsa_circ_0007919通过LIG1介导的修复途径抑制DNA损伤
作者为了进一步研究hsa_circ_0007919如何抑制DNA并影响PDAC细胞对GEM的敏感性，通过RNA-seq鉴定了hsa_circ_0007919干扰后的差异基因表达（520个显著上调及219个显著下调的基因），并通过KEGG和GSEA分析显示这些基因多中在DNA损伤修复途径进行表达。其中LIG1是下调最明显的基因，此前报道该基因在DNA重组中发挥重要作用。并发现LIG1在GEM耐药PDAC组织中高表达，与hsa_circ_0007919高表达呈正相关趋势，并通过干扰/过表达hsa_circ_0007919发现LIG1的mRNA/蛋白表达水平被下调/上调。这些结果表明，hsa_circ_0007919诱导LIG1表达激活DNA损伤修复途径，增强PDAC细胞对GEM的抗性。
图4. hsa_circ_0007919通过LIG1介导的DNA损伤修复途径调控PDAC的GEM耐药性
四、LIG1逆转了hsa_circ_0007919对细胞增殖、凋亡和DNA损伤的影响
作者为了证实LIG1是hsa_circ_0007919的下游靶点，通过干扰LIG1的表达发现会影响PDAC细胞增殖减少，但细胞凋亡和DNA损伤增加，同时过表达LIG1也会回补hsa_circ_0007919被干扰后影响的细胞增殖、凋亡和DNA损伤现象。这些结果表明，hsa_circ_0007919通过增加LIG1的表达，促进细胞增殖，减少细胞凋亡和DNA损伤。
图5. LIG1回补了干扰hsa_circ_0007919的表达对细胞增殖、凋亡和DNA损伤效应
五、hsa_circ_0007919结合FOXA1和TET1促进LIG1转录
作者为了研究hsa_circ_0007919如何调控LIG1的表达，通过FISH/核质分离实验发现hsa_circ_0007919主要分布在细胞核中，利用circAtlas和SPP数据库绘制了韦恩图确定了FOXA1与hsa_circ_0007919结合及LIG1启动子结合的最显著的蛋白，并进一步利用STRING数据库预测了FOXA1的互作蛋白TET1。在前人研究中报道FOXA1可作为多种癌症中的转录因子；TET1作为DNA甲基化酶来降低基因的启动子甲基化水平并促进其转录。因此，作者进一步预测hsa_circ_0007919与FOXA1、TET1结合来促进LIG1的转录。通过干扰FOXA1及TET1/CO-IP实验发现LIG1的表达降低及FOXA1及TET1之间具有相互作用。进一步在干扰FOXA1的基础上干扰TET1，发现LIG1的表达降低，相反，过表达TET1可以回补FOXA1对LIG1的抑制作用，这表明了FOXA1和TET1可以协同调控LIG1的表达。并设计了ChIRP/RIP实验证实了hsa_circ_0007919可与FOXA1和TET1结合互作。
图6. hsa_circ_0007919在GEM耐药 PDAC细胞中结合FOXA1和TET1调控LIG1的表达
为了研究FOXA1、TET1与LIG1启动子之间的相互作用，作者使用JASPAR和MethPrimer 2.0数据库分析了FOXA1与LIG1启动子的结合位点及预测了LIG1启动子中的CpG岛，进一步选取了启动子区域-1411至-1273的区域进行分析，同时发现利用5-杂氮胞苷5-AzaC处理增加了GEM耐药细胞中LIG1的表达；同时ChIP实验结果也证明了FOXA1和TET1与LIG1启动子区的P1结合；通过荧光素酶报告基因实验发现下调/上调hsa_circ_0007919、FOXA1或TET1会降低/增强LIG1启动子的转录。这些结果进一步表明hsa_circ_0007919通过结合FOXA1和TET1增强了LIG1的转录。
图7. hsa_circ_0007919招募FOXA1和TET1调控LIG1的转录
六、GEM通过增强QKI介导的反向剪切诱导hsa_circ_0007919的表达
据前人报道称，QKI和FUS/ADAR1可以促进/抑制circRNA的行成，作者为了进一步分析hsa_circ_0007919高表达的原因，发现QKI和FUS/ADAR1与hsa_circ_0007919表达呈现正相关/负相关。在GEM耐药细胞中感染QKI的表达，会诱导hsa_circ_0007919的表达下调。同时针对QKI会与pre-mRNA中的内含子结合介导circRNA的形成，通过RIP实验结果显示，在GEM抗性的PDAC细胞中，intron2及16的富集表达增加，这些结果表明GEM通过介导QKI与hsa_circ_0007919的侧翼内含子之间互作，来促进hsa_circ_0007919的环化形成及表达。
图8. GEM通过增强QKI介导的反向剪切诱导hsa_circ_0007919的表达
小结
作者描述了GEM增强QKI介导的hsa_circ_0007919剪切及环化模式，并揭示hsa_circ_0007919可以通过招募FOXA1和TET1来调节LIG1的转录及调控DNA损伤修复途径，这些机制有助于理解hsa_circ_0007919可作为下一个PDAC治疗的潜在靶点。
图9. GEM通过增强QKI介导的反向剪切诱导hsa_circ_0007919的分子调控机制
参考文献
[1] Wood LD, Canto MI, Jaffee EM, Simeone DM. Pancreatic Cancer: Pathogenesis, Screening, Diagnosis, and Treatment. Gastroenterology. 2022 Aug;163(2):386-402.e1. doi: 10.1053/j.gastro.2022.03.056. Epub 2022 Apr 7. PMID:35398344; PMCID: PMC9516440.
[2] Macheret M, Halazonetis TD. DNA replication stress as a hallmark of cancer. Annu Rev Pathol. 2015;10:425-48. doi: 10.1146/annurev-pathol-012414-040424. PMID: 25621662.
[3] Xu X, Zhang J, Tian Y, Gao Y, Dong X, Chen W, Yuan X, Yin W, Xu J, Chen K, He C, Wei L. CircRNA inhibits DNA damage repair by interacting with host gene. Mol Cancer. 2020 Aug 24;19(1):128. doi: 10.1186/s12943-020-01246-x. PMID: 32838810; PMCID: PMC7446195.
[4] Zhou X, Liu K, Cui J, Xiong J, Wu H, Peng T, Guo Y. Circ-MBOAT2 knockdown represses tumor progression and glutamine catabolism by miR-433-3p/GOT1 axis in pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2021 Apr 8;40(1):124. doi:10.1186/s13046-021-01894-x. PMID: 33832516; PMCID: PMC8034179.