环状RNA（circRNA）是单链共价闭环结构，其功能包括作为miRNA海绵、蛋白质调节因子和蛋白质合成模板等。circRNA翻译蛋白的功能是近来circRNA的研究热点。这里跟大家分享近日发表在EXP Mol Med上的一篇关于circRNA翻译机制的综述文章。文章题为“Molecular mechanisms of circular RNA translation”[1]，作者为韩国科学技术院的Yoon Ki Kim和Hyun Jung Hwang。
一、翻译起始
1. mRNA典型依赖帽结构翻译
真核mRNA的5′ -cap和3′ -poly(A) 尾在mRNA招募核糖体时起关键作用。翻译起始因子(eIF) 4E结合5′ -cap，招募eIF4G(具有多个eIFs结合位点)和eIF3复合物；同时PABP1结合3 ‘ -poly(A)尾。PABP1与eIF4G直接接触，使mRNA 5 ‘和3 ‘端靠近，形成有利于翻译的突环结构。核糖体的小亚基(40S)装载到5 ‘端，扫描翻译起始密码子（AUG），当定位到AUG密码子，核糖体的大亚基(60S)加入40S核糖体复合体，开始蛋白质合成。除典型的帽依赖性翻译外，核糖体还可通过各种方式被招募到mRNA中。原则上，只要将40S核糖体装载到mRNA上，就有扫描和结合60S启动蛋白质合成的潜力。（图1）
图1. 典型依赖帽结构翻译的示意图
2. 内部核糖体进入位点（IRES）介导的内部翻译起始
由于circRNAs缺乏5′ -cap和3′ -poly(A) 尾，核糖体的内部装载是circRNA启动翻译的唯一手段。
图2. circRNA内部翻译起始的各种机制
典型IRESs是通过不依赖帽结构机制，将40S招募到5’UTR并促进mRNA翻译的RNA二级或三级结构。后续研究发现，IRES介导的有效翻译依赖于一系列的eIFs和IRES特异性反式作用因子。很多IRES序列或元件没有独特的二级或三级结构，因此典型的IRESs和其它能促进核糖体内部进入的IRESs样序列或元件都被称为IRESs。
2.1 m6 A修饰介导的内部翻译起始
m6A是哺乳动物mRNA中最常见的内部修饰，影响mRNA的转录、pre-mRNA剪接、核输出、mRNA稳定性和翻译等。目前已经鉴定了包括YTHDF1-3、eIF3和METTL3在内的数十种识别m6A的RBPs。
m6A以多种方式促进线性mRNA的有效翻译。当mRNA的5’UTR含有m6A，eIF3直接识别m6A位点，促进翻译起始。含有m6A的circRNAs可能采用这种策略招募核糖体。
线性mRNA 3’UTR中m6A也可被YTHDF1、YTHDF3或METTL3识别，招募eIF3或eIF3h，形成有利于翻译的环突结构，促进翻译。m6A修饰的circRNA也可能以相似的机制进行内部翻译起始。YTHDF3被证明可以识别circRNA中的m6A并招募eIF4G2和eIF3，导致40S的内部进入[2]。
2.2 eIF4A3或外显子连接复合物(EJC)介导的内部翻译起始
circRNA上的40 S内部装载可以通过EJC介导。EJC是一种特殊的多蛋白复合体，在典型核剪接后的外显子-外显子接头上游约20-24nt处聚集。EJC装载到成熟的mRNA后，在基因调控机制中发挥多方面的作用，包括pre-mRNA剪接、mRNA输出、翻译和mRNA稳定性。
已有研究证明了EJC在circRNA翻译中的直接作用[3,4]。反向剪接生成circRNA过程，EJC被装载到BSJ上，EJC可与eIF4A3和eIF3G(eIF3复合物的一个亚基)相互作用招募eIF3复合物。EJC作为分子支架将eIF3复合体和40s招募到circRNA，驱动内部翻译起始。eIF4A3本身具有依赖eIF3启动内部翻译的能力，而EJC复合物的存在进一步增强了翻译能力。
二、circRNA翻译的各种开放阅读框（ORF）
核糖体装载到circRNA上，如有ORF，就可能启动蛋白质合成。circRNA与其pre-mRNA其它翻译的蛋白相比，可能有相同、相似或嵌合的形式。circRNA翻译起始密码子(AUG或非AUG密码子)、终止密码子(UAA、UAG和UGA)和BSJ相对位置的不同，会导致多种同工型蛋白质的产生(图3)，还会影响circRNA的稳定性。
1. circRNA翻译起始和终止
多个起始密码子或非AUG起始的circRNA可产生多种蛋白质。已知多种circRNA经过反向剪接产生新的ORF，生成新的嵌合蛋白。例如，circZNF609的终止密码子位于起始密码子的上游及BSJ下游，至少有两个环化产生的ORF，能合成新的嵌合蛋白，可产生至少三种蛋白[5,6]。
第二轮翻译后定位到框内终止密码子也会产生嵌合蛋白。核糖体翻译组分析在胶质母细胞瘤和正常脑组织样本中发现了1879种可翻译的circRNA。其中circ-E-Cad不含框内终止密码子，第二轮翻译之后才出现框内终止密码子，生成蛋白中240 aa在第一轮翻译中生成，14 aa在第二轮翻译中通过自然移码生成[7]。
2. circRNA起始和终止密码子重叠
circRNA的AUG起始密码子可能与终止密码子重叠。例如，水稻黄斑病毒circRNA的较短可翻译ORF(220nt)，有重叠的起始和停止密码子(UGAUGA)，可合成16-39 kDa的蛋白质，相当于翻译了5轮[8]。
3. circRNA翻译起始和终止影响稳定性
线性mRNA剪接后，装载的EJCs会被延伸的核糖体移出。如果EJC在翻译终止后仍然在mRNA上，则该mRNA被认为是有缺陷的转录本，被mRNA监视机制迅速降解，即无义介导的mRNA衰变(NMD;图3a左)。
同样在circRNA中，如BSJ位于终止密码子的远端下游，翻译终止后，EJC仍在BSJ附近，circRNA将被识别为错误转录本，通过NMD迅速消除(图3a右)。如果BSJ位于终止密码子上游，则BSJ附近的EJC被延伸的核糖体移位，circRNA逃避NMD并稳定存在(图3b)。
4. circRNA无终止翻译
当线性mRNA缺乏终止密码子时，核糖体会延伸到mRNA的末端，并出现A位点空核糖体的独特结构，则会表达一种可能具有潜在毒性的c端延伸蛋白。为减少该情况，真核细胞进化出无终止的mRNA衰变(NSD) 这种mRNA监视机制，将缺乏终止密码子的转录本识别为有缺陷的转录本，并将其迅速降解(图3c，左)。
当circRNA缺乏框内终止密码子，装载的核糖体会在无终止的ORF中无限地合成蛋白质，即滚环翻译(图3c右)。滚环翻译合成具有重复ORF序列的多聚体高分子量蛋白质。滚环翻译的circRNA可逃避降解mRNA的NSD。
图3. circRNA中各种ORF及其对circRNA稳定性的影响
总结
越来越多的证据支持内源性circRNA通过内部装载核糖体进行翻译。circRNA翻译蛋白质和多肽的作用正在不断丰富，开创了一个包括癌症、干细胞和多能性等生物和生理过程研究的新时代。然而，关于circRNA翻译仍有很多问题有待解决。首先，需要开发更灵敏的方法检测circRNAs翻译产物。其次，需确定由circRNA翻译产物在生物和生理过程中的作用。最后，需要更进一步研究circRNA招募核糖体的详细分子机制。利用更先进的技术和生物信息学方法全面研究circRNA结构及翻译机制，回答这些问题便指日可待。
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RNA翻译研究思路
参考文献
[1] Hwang HJ, Kim YK. Molecular mechanisms of circular RNA translation. Exp Mol Med. 2024. doi: 10.1038/s12276-024-01220-3.
[2] Yang, Y. et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine. Cell Res. 27, 626–641 (2017).
[3] Chang, J. et al. An interaction between eIF4A3 and eIF3g drives the internal initiation of translation. Nucleic Acids Res. 51, 10950–10969 (2023).
[4] Lin, H. H. et al. Exon junction complex mediates the cap-independent translation of circular RNA. Mol. Cancer Res. 21, 1220–1233 (2023).
[5] Legnini, I. et al. Circ-ZNF609 is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Mol. Cell 66, 22–37.e29 (2017).
[6] Ho-Xuan, H. et al. Comprehensive analysis of translation from overexpressed circular RNAs reveals pervasive translation from linear transcripts. Nucleic Acids Res. 48, 10368–10382 (2020).
[7] Gao, X. et al. Circular RNA-encoded oncogenic E-cadherin variant promotes glioblastoma tumorigenicity through activation of EGFR-STAT3 signalling. Nat. Cell Biol. 23, 278–291 (2021).
[8] AbouHaidar, M. G., Venkataraman, S., Golshani, A., Liu, B. & Ahmad, T. Novel coding, translation, and gene expression of a replicating covalently closed circular RNA of 220 nt. Proc. Natl Acad. Sci. USA 111, 14542–14547 (2014).