CircPDIA3/miR-449a/XBP1通路通过抑制GSDME-C结构域的棕榈酰化来诱导结直肠癌的化疗耐药性来抑制细胞焦亡

结直肠癌（CRC）是全球第二大最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第三大原因。奥沙利铂（OXA）被广泛应用于结直肠癌（CRC）的一线治疗，而结直肠癌复发通常是由于OXA耐药性。OXA耐药性与多种因素有关，包括焦亡的异常调控。所以，阐明细胞焦亡的异常调控机制具有重要意义。作者发现环状RNA circPDIA3在结直肠癌的化疗耐药性中发挥了重要作用，CircPDIA3在体内外均可通过抑制细胞焦亡来诱导结直肠癌的化疗耐药性。因此，本研究为环状RNA调控焦亡的机制提供了新的见解，并为逆转结直肠癌的化疗耐药性提供了一个潜在的治疗靶点。

2024年5月22日，中山大学附属第三医院肝外科和肝移植中心郑俊以及中国南方医科大学广东省人民医院胃肠外科李勇、郑佳彬、潘子豪团队在Drug Resistance Updates（IF=15.8）发表文章CircPDIA3/miR-449a/XBP1 feedback loop curbs pyroptosis by inhibiting palmitoylation of the GSDME-C domain to induce chemoresistance of colorectal cancer。本研究表明circPDIA3直接与GSDME-C结构域结合，通过阻断ZDHHC3和ZDHHC17的GSDME-C结构域棕榈酰化，增强GSDME-C结构域的自抑制作用，从而抑制细胞焦亡。这些发现为了解circRNA如何通过RNA结合蛋白（RBP）调控细胞焦亡的方式诱导化疗耐药提供了信息，同时也为预防和治疗CRC化疗耐药提供了新的靶点和方向。

circPDIA3在CRC中的鉴定

作者首先对OXA治疗敏感/耐受的CRC患者组织进行RNA测序分析，并结合circRNA在线数据库筛选出hsa_circ_0002891（称为circPDIA3）（图1B-C）。

作者通过Sanger测序鉴定了circPDIA3的特异性剪接位点（图1D）。此外，作者研究了circPDIA3在结直肠癌细胞和正常结直肠上皮细胞中的表达。数据显示，circPDIA3在CRC细胞系中的表达显著高于NCM460细胞（图1E）。作者通过背靠背引物验证，结合RNase R和放线菌素D处理实验，表明circPDIA3的环状结构相对更稳定（图1F-H）。核RNA和细胞质RNA分析和FISH实验发现cirPDIA3主要定位于细胞质（图1I-J）。

CircPDIA3促进了体外化疗的耐药性

作者构建了circPDIA3 敲低载体和过表达载体。结果发现，敲低或过表达circPDIA3对PDIA3的线性表达没有影响（图2A）。CCK-8试验表明，敲低circPDIA3可使OXA耐药细胞对OXA敏感，而过表达 circPDIA3 则相反（图 2B）。同样，克隆形成和EdU检测也表明，circPDIA3的下调增加了OXA耐药细胞对OXA的敏感性，circPDIA3的上调则相反（图2C-D）。此外，凋亡检测证实，在circPDIA3敲低的OXA耐药细胞中，经OXA处理的Annexin V+、PI+单染的细胞的总百分比显著增加，而过表达circPDIA3相反（图2E）。综上所述，体外实验表明，circPDIA3与CRC细胞中的OXA耐药性有关。

CircPDIA3促进了PDX模型和CRC患者的化疗耐药性

作者利用CRC患者组织建立了异种移植（PDX）模型（图3A）。并通过在肿瘤内注射circPDIA3 ASO，观察到ASO-circPDIA3组对OXA的敏感性高于ASO-NC组（图3B-D）。IHC染色证实，Ki- 67的表达随着circPDIA3的减少而降低（图3E-F）。qRT-PCR检测表明ASO-circPDIA3显著抑制了circPDIA3的表达（图3G）。临床研究表明，有复发或转移的CRC患者中circPDIA3的表达高于无复发或转移的患者（图3H）。Kaplan-Meier曲线证实，circPDIA3高表达的患者的DFS率明显低于circPDIA3低表达的患者（图3I）。综上所述，circPDIA3可以作为CRC患者OXA反应的独立预测因子。

CircPDIA3与GSDME以直接结合的方式相互作用

作者进一步研究与circPDIA3相互作用的蛋白质。RNA pulldown和质谱实验结果显示，GSDME是焦亡途径的关键效应因子，且丰度最高（图4A）。此外，circPDIA3可以与内源性或重组GSDME相互作用，表明circPDIA3与GSDME直接结合（图4B-C）。在GSDME RIP实验中，circPDIA3的显著富集（图4D）。此外，circPDIA3 和GSDME 在CRC细胞中显示细胞质共定位（图4E）。

此外，利用RNA-蛋白相互作用预测（RPISeq）鉴定circPDIA3相互作用蛋白，发现circPDIA3可能直接与GSDME相互作用。然后，使用catRAPID平台，分析circPDIA3核苷酸与GSDME残基之间的精确相互作用（图4F-G）。为了验证GSDME上的circPDIA3结合区域，作者构建了带有Flag标记的全长GSDME及其缺失的突变体（图4H）。RNA pulldown和RIP分析证实，GSDME的C结构域区域，是其与circPDIA3相互作用的关键（图4I-J）。此外，作者还使用HADDOCK2.4上的计算机算法分析了circPDIA3和GSDME的相互作用（图4K）。综上所述，circPDIA3在CRC细胞中与GSDME发生相互作用。

CircPDIA3增强了GSDME-C结构域的自抑制作用

作者进一步发现circPDIA3敲除的OXA抗性细胞在OXA反应时表现出更明显的细胞肿胀和球囊样肿胀的微观特征，这是焦亡细胞的形态学特征（图5A）。细胞LDH释放实验，结果显示circPDIA3的下调显著增加了OXA耐药细胞向细胞上清中LDH的释放。（图5B）。在OXA耐药细胞中，circPDIA3的敲低减少了激活的caspase-3对GSDME的裂解，而过表达则相反（图5C）。

作者推测circPDIA3可能通过与GSDME-C结构域相互作用，参与调控GSDME的自抑制，从而抑制GSDME的焦亡。Co-IP试验表明，circPDIA3显著增强了GSDME-C-残基结构域的相互作用，且呈剂量依赖性（图5D-E）。同时，circPDIA3的过表达抑制了293 T细胞中的焦亡（图5F-G）。此外，circPDIA3过表达促进了GSDME-C结构域与GSDME-N结构域结合，从而抵消了GSDME-N结构域触发焦亡的活性（图5H-I）。作者进一步将GSDME-C结构域的氨基酸进行细分，进行缺失突变。这些缺失突变表明293 T细胞在circPDIA3存在的情况下发生焦亡（图5J-K）。且减弱了GSDME-N结构域和GSDME-C结构域之间的相互作用（图5L）。综上所述，circPDIA3通过与GSDME-C结合，增加了GSDME-C与GSDME-N的相互作用，从而上调了GSDME的自抑制，而不是持续诱导焦亡。

CircPDIA3抑制的GSDME-C棕榈酰化放大了GSDME-C结构域的自抑制作用

为了检测circPDIA3是否参与了GSDME-C结构域棕榈酰化的调控，作者用脱脂酰化酶抑制剂棕榈酰抑制素B（PalmB）处理293 T细胞。PalmB消除了circPDIA3对GSDME-C结构域棕榈酰化的抑制。相比之下，棕榈酰化抑制剂2-溴磷磷酸酯（2-BP）的处理进一步减弱了GSDME-C结构域的棕榈酰化（图6A）。在circPDIA3存在下，GSDME-C结构域与GSDME-N结构域的相互作用被PalmB阻断，而被2-BP进一步增强，表明circPDIA3负调控GSDME-C结构域棕榈酰化（图6B）。接着作者进一步鉴定了参与调控GSDME-C结构域棕榈酰化的特异性ZDHHC棕榈酰基转移酶，结果发现，ZDHHC3和ZDHHC17可能通过激活293 T细胞中的GSDME-C结构域棕榈酰化来抑制GSDME-C结构域的自抑制（图6C-E）。同样，过表达circPDIA3可以消除ZDHHC3或ZDHHC17对GSDME-C结构域棕榈酰化的促进作用，并提高GSDME-C结构域的自抑制作用（图6D-E）。

棕榈酰化主要发生在4个C残基上，只有当所有四个候选C残基都发生突变（GSDME-C 4CA）时，GSDME-C结构域的棕榈酰化才被消除。当ZDHHC3或ZDHHC17过表达时，GSDME-C结构域的棕榈酰化增强，其自抑制作用减弱，而GSDME-C 4CA没有明显变化（图6F-G）。与预期一致的是，当这四个C残基突变为A残基时，circPDIA3由于无法抑制GSDME-C结构域的棕榈酰化而失去了增强其自抑制作用的能力（图6H-I）。综上所述，circPDIA3通过抑制GSDME-HHC3-和ZDHHC17依赖的GSDME-C结构域的棕榈酰化，增强了GSDME-C结构域的自抑制作用。

CircPDIA3在体内外发挥OXA耐药促进作用，依赖于与GSDME的结合

基于circPDIA3与GSDME-C结构域的特异性结合区域，进一步探讨circPDIA3是否通过与GSDME-C结构域结合抑制GSDME-C棕榈酰化来促进OXA抗性，作者构建并验证了circPDIA3 突变质粒（circPDIA3-MUT）（图7A-B）。同时，RIP实验证实，circPDIA3-MUT质粒不能与GSDME结合（图7C）。CCK-8检测、集落形成、EdU检测和凋亡检测证实，阻断circPDIA3与GSDME的结合会增加体外CRC细胞对OXA的敏感性（图7D-G）。与野生型circPDIA3相比，转染circPDIA3-MUT的OXA敏感细胞对OXA表现出更明显的细胞肿胀和球囊状肿胀的微观特征，而细胞LDH释放试验显示circPDIA3-MUT显著增加了OXA敏感细胞上清中LDH的释放（图7H-I）。Western blot实验证实突变体circPDIA3恢复了裂解的GSDME-N结构域（图7J）。此外，共免疫共沉淀分析表明，突变体circPDIA3丧失了增强GSDME-C结构域与GSDME-N结构域相互作用的能力（图7K-L）。与预期一致，突变体circPDIA3不能抑制GSDME-C结构域棕榈酰化（图7M）。因此，circPDIA3依赖于与GSDME的结合来促进OXA的抗性。

接下来，作者在小鼠模型中研究了突变体circPDIA3在调节OXA抗性中的作用。结果表明，circPDIA3-MUT组的肿瘤体积和重量明显大于circPDIA3组（图7N-P）。IHC分析显示，circPDIA3-MUT组的Ki-67水平降低（图7Q-R）。血清LDH分析显示，与circPDIA3组相比，circPDIA3-MUT组的LDH释放量减少，这与体外实验结果一致（图7S）。此外，免疫印迹分析显示，circPDIA3-MUT组的GSDME-N增加，证明重新激活焦亡（图7T）。综上所述，circPDIA3 使小鼠细胞对 OXA 处理敏感，并依赖于GSDME的结合。

circPDIA3在CRC中的表达受XBP1调控

由于PDIA3转录驱动circPDIA3的表达，作者推测参与调控PDIA3转录的转录因子可能对circPDIA3发挥类似的作用。作者使用了PROMO数据库和GEPIA数据库预测出XBP1与PDIA3的正相关性最强（图8A-B）。qRT-PCR分析显示，过表达XBP1上调了circPDIA3的表达，而下调XBP1则相反（图8C）。通过分析JASPAR数据库，在PDIA3启动子区域（R1和R2）上发现了两个XBP1结合基序，并据此为这些区域设计了两个引物（P1和P2）（图8D-E）。ChIP-PCR分析结果显示XBP1主要与P1区域的PDIA3启动子结合（图8F-G）。此外，构建野生型（WT）和突变型（MUT）PDIA3序列，荧光素酶报告基因分析显示，XBP1过表达显著增加了WT的荧光素酶活性，而XBP1敲低得到相反的结果（图8H-I）。综上所述，XBP1通过与PDIA3启动子结合，促进circPDIA3的表达。

CircPDIA3通过海绵化miR-449a形成一个上调XBP1的正反馈回路

研究表明，过表达circPDIA3增加了CRC细胞中XBP1的表达水平（图9A）。随后，作者使用了starBase 、miRDB、circMine和TargetScan预测出miR-34a-5p和miR-449a与circPDIA3和XBP1相互作用（图9B）。RNA pulldown结果发现miR-449a被CRC细胞中生物素标记的circPDIA3探针显著捕获（图9C）。双荧光素酶结果显示，circPDIA3可以与miR-449a相互作用（图9D-E）。此外，RIP实验进一步说明了circPDIA3与miR-449a结合的特异性（图9F），表明circPDIA3可能海绵吸附miR-449a。接下来，作者分析验证了miR-449a与XBP1的3‘非翻译区（3’UTR）之间的关系。结果表明miR-449a可以通过靶向3‘UTR区调控XBP1的表达（图9G-J）。

为了探索circPDIA3、miR- 449a和XBP1之间的相互作用关系，荧光素酶报告基因分析显示，circPDIA3过表达显著增加了WT XBP1 3‘UTR的荧光素酶活性，而共转染miR- 449a模拟物则抵消了这种效应（图9K）。qRT-PCR和Western blot检测，结果证实circPDIA3过表达显著上调了XBP1的mRNA和蛋白水平，而共转染miR-449a模拟物消除了这种效应，反之亦然（图9I-J）。QRT-PCR结果显示，XBP1在CRC组织中的表达水平与circPDIA3水平呈正相关，与miR-449a水平呈负相关。综上所述，circPDIA3可以作为ceRNA海绵化miR-449a，调控XBP1的表达，形成一个正反馈回路。

circPDIA3的抑制增加了体内对OXA的敏感性

为了进一步研究ASO-circPDIA3联合OXA对体内肿瘤生长的影响，作者建立了一个基于过表达circPDIA3的HCT116细胞的异种移植小鼠模型。结果表明，与单独缺乏circPDIA3相比，抑制circPDIA3联合OXA治疗后，肿瘤体积和重量减少，表明抑制circPDIA3显著使小鼠细胞对OXA治疗敏感（图10A-D）。IHC分析显示，在ASO-circPDIA3 + OXA组中发现Ki-67水平下降（图10E-F）。此外，qRT-PCR实验验证了ASO-circPDIA3在肿瘤组织中的有效抑制作用（图10G）。血清LDH分析显示，与其他各组相比，ASO-circPDIA3 + OXA组的LDH释放量减少，与体外实验结果一致（图10H）。此外，Western blot分析显示，ASO-circPDIA3 + OXA组表现出GSDME-N水平的升高，这为circPDIA3表达降低激活体内焦亡提供了证据（图10I）。综上所述，抑制circPDIA3可以显著提高CRC细胞对OXA的敏感性。

图10 CircPDIA3有助于CRC细胞体内OXA耐药

总结

总之，circPDIA3在结直肠癌中高表达，并与结直肠癌患者的OXA耐药和DFS较差呈正相关。本研究鉴定了GSDME-C结构域作为circPDIA3的靶点，并证明了circPDIA3可以抑制焦亡。在机制上，由于circPDIA3抑制了GSDME-C结构域的棕榈酰化，从而放大了GSDME-C结构域的自抑制作用，从而增强了GSDME-C结构域对GSDME-N结构域的抑制作用。此外，本研究还验证了一个circPDIA3/ miR-449a/XBP1正反馈回路的存在，可诱导化疗耐药性。综上所述，本研究探索了circPDIA3在结直肠癌中的化疗耐药作用，结果提示circPDIA3可以作为克服结直肠癌患者OXA耐药的潜在生物标志物和治疗靶点。