嵌合抗原受体(CAR) T细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面极具前景。然而，这仅限于个体化细胞治疗，仍然面临各种挑战，如成本高、准备时间长、对实体瘤的疗效有限。解决这些挑战并提高CAR-T细胞疗法的有效性是非常重要的。mRNA技术可有效解决基因组整合的安全性问题，有望使CAR-T疗法在不同的临床情况下得到更广泛和更便捷的应用。
环状RNA (circRNAs)是共价封闭的环状RNA分子，比线性mRNA更稳定。因此，利用 circRNA在功能性免疫细胞的细胞膜上表达CAR可能比mRNA表达量更高、表达更持久，从而产生更有效的抗肿瘤免疫。
近日，复旦大学璩良、徐一驰和邱敏研究员联合中国科学院北京纳米能源与系统研究所罗聃研究员在BioRxiv预印本上传研究论文：Synergically enhanced anti-tumor immunity of in vivo CAR by circRNA vaccine boosting，描述了利用免疫细胞趋向性的LNP体内递送编码CAR蛋白的circRNACAR，显著抑制肿瘤生长，并诱导促炎症小鼠肿瘤微环境；共同使用circRNAAnti-HER2-CAR与编码HER2抗原的癌症疫苗circRNAHER，可协同增强的抗肿瘤活性。该研究表明，基于circRNA体内表达CAR与肿瘤抗原(称为体内CAR- VAC)的结合，有可能成为一种升级的成品免疫疗法。
CircRNACAR可在T细胞和巨噬细胞中有效表达CAR蛋白
研究团队对HER2 CAR序列进行密码子优化后，采用I型内含子自剪接策略合成表达HER2 CAR蛋白的circRNA（circRNACAR），采用HPLC和RNase R处理得到高纯度circRNACAR，将circRNACAR转染到细胞中，通过Western Blot验证CAR蛋白的表达，选出表达最高效的circRNACAR-opt-3进行下一步研究。（图1a-g）
CircRNACAR有效介导T细胞和巨噬细胞的肿瘤杀伤作用
研究团队将转染了CircRNAAnti-HER2-CAR的Jurkat细胞（永生人类T细胞）、THP-1（永生化人类巨噬细胞）或J774A.1（永生化小鼠巨噬细胞）分别与不同的靶向肿瘤细胞共培养。结果显示，转染CircRNAAnti-HER2-CAR的三种细胞均能以剂量效应显著杀伤表达HER2的肿瘤细胞。此外，研究团队还验证了编码anti-CD19 CAR蛋白的circRNA，也可以杀伤异位表达CD19抗原的A549肺癌细胞。综上，circRNACAR可在体外介导T细胞和巨噬细胞的肿瘤杀伤活性。（图1h-q）
图1 CircRNACAR在T细胞和巨噬细胞中有效表达CAR蛋白，并介导显著的肿瘤杀伤作用。
circRNACAR可诱导巨噬细胞的高效肿瘤吞噬作用和促炎极化
研究团队将转染circRNACAR的THP-1或J774A.1细胞，然后分别与多种靶向肿瘤细胞共培养。结果显示，circRNACAR能显著诱导THP-1或J774A.1细胞对不同癌症细胞的吞噬能力，且转染circRNACAR的THP-1和J774A.1都表现为促炎极化。（图2a-k）
研究团队进一步通过RNA-seq分析，结果发现转染circRNACAR的THP-1细胞中存在一系列促炎功能、吞噬能力、代谢和其他免疫反应相关的基因表达上调，表明circRNACAR具有诱导巨噬细胞M1极化的潜力。（图2l-n）
图2 巨噬细胞表现出circRNACAR诱导的有效肿瘤吞噬作用和促炎极化。
筛选将环状RNA有效递送到小鼠免疫细胞中的脂质纳米粒
脾脏主要由T细胞、B细胞和巨噬细胞等免疫细胞组成，是LNPs靶向递送circRNACAR的重要免疫器官。此外，肿瘤微环境中含有大量的肿瘤相关巨噬细胞、T细胞和树突状细胞。研究团队通过改造阳离子脂质的头部和尾部集团，最终筛选出靶向脾脏的LNP。研究团队将LNP-circRNALuciferase静脉注射到BALB/c小鼠体内，验证了该LNP靶向脾脏；注射到皮下成瘤小鼠的肿瘤中，验证了该LNP集中分布在肿瘤区域。综上，LNP-circRNA能在体内高效递送到免疫细胞中。此外，研究团队还验证了前人研究的选择性ORgan靶向（SORT）方法，也能分别靶向脾脏和肿瘤区域。（图3a-h）
图3 筛选能有效将circRNAs递送到小鼠免疫细胞中的脂质纳米粒。
CircRNACAR有效抑制小鼠肿瘤生长并延长存活时间
该研究发现，静脉注射SORT-LNP circRNACAR到CT26-HER2结直肠癌BALB/c小鼠中，能显著抑制肿瘤生长。LNP-circRNACAR瘤内给药能显著抑制BALB/c小鼠皮下CT26-HER2结肠癌肿瘤、4T1乳腺癌肿瘤、MC38-HER2结肠癌肿瘤生长，甚至可实现皮下瘤的完全消退，延长荷瘤小鼠的存活时间。总之，circRNA体内表达CAR在治疗实体瘤方面具有很好的疗效。（图4a-l）
图4 circRNACAR有效抑制小鼠的肿瘤生长并延长存活时间。
CircRNACAR将小鼠的肿瘤微环境调整为促炎状态
实体瘤通常难治，部分原因是抑制免疫的肿瘤微环境。CircRNACAR是否会影响小鼠的肿瘤微环境呢？研究团队利用流式细胞术/IHC检测小鼠脾脏和肿瘤组织中的免疫细胞，发现circRNACAR治疗的小鼠模型脾脏和肿瘤组织中CD8+T、 CD4+T等促炎相关细胞比例增加，但Treg细胞的比例降低。H&E染色结果显示，circRNACAR治疗组的肿瘤细胞死亡显著增加。（图5a-d）
研究团队进一步对免疫细胞进行了RNA-seq分析，结果显示circRNACAR组有一系列的促炎相关基因上调，表明肿瘤微环境中存在免疫细胞浸润；多个与B细胞免疫相关的通路显著上调，表明抗体可能在体内CAR治疗的抗肿瘤免疫中发挥重要作用。由这些结果可见，在荷瘤小鼠模型中，circRNACAR可以显著地将肿瘤微环境重塑为促炎状态，这有助于增敏免疫治疗。（图5e-f）
图5 CircRNACAR将小鼠肿瘤微环境重塑为促炎状态。
CircRNA疫苗通过抗体介导的细胞毒性协同增强体内CAR治疗的抗肿瘤活性
RNA-seq结果发现circRNACAR的抗肿瘤作用可能与B细胞反应有关。抗体依赖的细胞毒性（ADCC）或者细胞吞噬作用（ADCP）可以促进巨噬细胞或NK细胞的吞噬或杀伤作用。此外，CAR疫苗已被证实可提升CAR-T细胞抗肿瘤效应。因此，团队进一步研究circRNA疫苗能否以ADCC或ADCP效应，协同增强基于circRNA体内表达CAR的抗肿瘤免疫治疗。
研究团队开发了一种高效表达和分泌HER2融合蛋白抗原的circRNA疫苗（circRNAVAC）。体内验证结果表明， CT26-275 HER2结直肠癌C57BL/6小鼠中，与PBS、单独circRNACAR或单独circRNAVAC治疗相比，静脉注射或瘤内注射circRNACAR和circRNAHER2疫苗的组合表现出更好的肿瘤抑制效果和存活率（图6a-i）
图6 CircRNA疫苗协同增强体内CAR疗法的抗肿瘤活性。
总结
该研究基于circRNA结合体内CAR和癌症疫苗建立了一种新的联合免疫疗法，在小鼠模型中验证了瘤内或静脉注射circRNA疫苗可协同提高基于circRNA的体内CAR的抗肿瘤免疫作用。
目前主流研究的CAR-T细胞疗法（嵌合抗原受体T细胞免疫）需要分离患者体内T细胞，通过基因工程技术使T细胞表达能识别肿瘤细胞并激活T细胞的嵌合抗原受体（即CAR），再将经过扩增的CAR-T细胞回输到患者体内，识别并攻击表达相关抗原的肿瘤细胞，是过继治疗（ACT）的方法之一。
与过继性体外CAR-T细胞疗法不同，该研究利用基于circRNA技术的体内CAR-T疗法，将编码特定CAR的circRNA递送到体内免疫细胞中，使体内免疫细胞表达CAR，识别并攻击表达相关抗原的肿瘤细胞。体内CAR-T疗法无需分离患者体内T细胞进行编辑、扩增、再回输，相比CAR-T细胞疗法，具有成本低、便捷、现货、无需骨髓清除、可重复使用且无基因组整合风险等优点。基于circRNA的CAR-T免疫疗法为未来治疗实体瘤提供了一种升级的新治疗策略。
璩良丨复旦大学基础医学院 研究员
璩良, 复旦大学基础医学院研究员，组建RNA疫苗技术与免疫治疗实验室，致力于新型RNA疫苗及治疗技术开发与免疫治疗研究。2022年曾在Cell杂志上首次报道circRNA疫苗技术平台、拓展了RNA治疗技术新领域。璩良教授确认出席第八届circRNA研究与产业论坛，并发表主题演讲，敬请期待！