慢性伤口是糖尿病患者的主要并发症。2024年5月，中山大学附属第七医院李海红研究员、中国人民解放军总医院付小兵院士和张翠萍研究员团队在Nat Commun（IF=14.7）上发表题为“circCDK13-loaded small extracellular vesicles accelerate healing in preclinical diabetic wound models”的文章，该研究鉴定了一种治疗性环状RNA circCDK13，并将其装载到小细胞外囊泡(sEV)中，以治疗临床前糖尿病模型的伤口。
circCDK13是一种有前景的糖尿病伤口治疗药物
研究团队通过生信分析，以及利用AGE-BSA处理人真皮成纤维细胞(HDFs)和人表皮角质形成细胞(HEKs)模拟糖尿病伤口体外微环境的实验，发现circCDK13在糖尿病足溃疡(DFU)中表达下调。（图1a-e）
circCDK13在HDFs和HEKs中的表征
研究通过收敛和发散引物进行PCR，结合Sanger测序/放线菌素D/RNase R耐受实验验证了circCDK13的环状结构（图1f-l），并通过FISH和核质分离实验证明circCDK13定位于细胞质中。（图1m-n）
图1. circCDK13在糖尿病创面中表达下调。
circCDK13在体外促进HDFs和HEKs的增殖和迁移
研究团队利用siRNA和过表达载体敲低/过表达HDFs和HEKs中circCDK13，通过CCK-8/EdU染色/划痕/Transwell实验，结果表明circCDK13使HDFs和HEKs活力和增殖水平显著提高，迁移能力明显增强。（图2）
图2 circCDK13在体外促进HDFs和HEKs的增殖和迁移。
circCDK13以依赖m6A的方式与IGF2BP3相互作用
研究通过RNA pull-down和LC-MS/MS分析，联合catRAPID omics v2.0预测IGF2BP3可能为与circCDK13互作的候选RBP；利用RNAfold预测circCDK13的二级结构，并用NPDock预测circCKD13和IGF2BP3的物理互作；通过RNApull-down/RIP-qPCR/FISH-IF进一步在HDFs和HEKs中证实了circCDK13和IGF2BP3相互作用。（图3a-j）
作者通过对circCDK13上IGF2BP3预测结合区进行突变，验证了IGF2BP3的KH结构域和circCDK13“ACAAACA”序列对两者互作的重要性。由于IGF2BP3是一种m6 A结合蛋白，通过MeRIP实验，研究团队发现METTL3和METTL14的缺失会破坏circCDK13和IGF2BP3的互作，并验证了circCDK13的m6A修饰维持circCDK13和IGF2BP3的相互作用。（图3k-o）
circCDK13和IGF2BP3之间的相互作用增强了彼此的稳定性
研究通过对敲低或过表达IGF2BP3进行qRT-PCR/Western Blot/放线菌素D实验，以及敲低或过表达circCDK13并利用环己亚胺抑制新蛋白合成实验，证明了circCDK13和IGF2BP3之间的相互作用增强了彼此的稳定性。（图3p-t）
图3 circCDK13以依赖m6A的方式与IGF2BP3相互作用。
circCDK13与IGF2BP3协同促进HDFs和HEKs的增殖和迁移
挽救实验证明，IGF2BP3和circCDK13协同促进HDFs和HEKs增殖和迁移。IGF2BP3或circCDK13敲低显著降低了c-MYC、CD44和CyclinD1蛋白的表达水平，而IGF2BP3或circCDK13过表达则有相反的结果。进一步的挽救实验也证明了circCDK13和IGF2BP3对c-MYC和CD44 mRNA的影响可能是相互依存的。（图4a-h）
研究通过circCDK13探针和IGF2BP3抗体pull-down实验，证明了circCDK13和IGF2BP3与c-MYC和CD44 mRNA相互作用。免疫荧光结果显示，与对照组相比，DFU组的HDFs和HEKs中IGF2BP3、c-MYC和CD44蛋白的表达水平显著降低（图3i）。结合文献报道，作者推测在HDFs和HEKs中，circCDK13和IGF2BP3通过增强c-MYC和CD44 mRNA的稳定性，增加c-MYC和CD44蛋白的表达，从而促进HDFs和HEKs的增殖和迁移。
图4 circCDK13与IGF2BP3协同促进HDFs和HEKs的增殖和迁移。
负载circCDK13的工程化sEVs的制备和特征
为了促进circCDK13在伤口愈合和组织再生中的潜在应用，研究团队构建了含有高丰度circCDK13的工程sEV。通过circCDK13慢病毒载体感染人胎盘绒毛膜来源的间充质干细胞(CPMSCs)（图5a），然后超速离心得到sEVs。团队通过TEM/NTA/WB验证sEV的特征（图5b-d），qPCR鉴定sEV中的circCDK13（图5e），利用RNase A/T1混合物或Triton X100的处理验证circCDK13oe – sEVs的负载效果（图5f）。
circCDK13oe – sEVs在体外促进HDFs和HEKs的增殖和迁移
研究团队使用CM-DiI标记sEVs，验证sEV在HDFs和HEKs中的成功内化（图5g）。circCDK13oe – sEVs与HDFs和HEKs共孵育，结果表明circCDK13oe – sEVs共孵育细胞中circCDK13丰度增加（图5h），circCDK13oe – sEVs可以促进HDFs和HEKs的增殖和迁移能力，消除AGE-BSA和高浓度D-葡萄糖(HG)对增殖和迁移的抑制作用（图5i-n），并显著上调IGF2BP3、c-MYC、CD44和Cyclin D1的蛋白表达水平（图5o）。
图5 circCDK13oe – sEVs促进HDFs和HEKs的增殖和迁移。
circCDK13oe – sEVs在体内加速伤口愈合
研究团队建立db/db糖尿病小鼠模型，或腹腔注射STZ建立I型糖尿病大鼠模型，并在背部创造两个全层皮肤伤口，然后皮下注射circCDK13oe – sEVs、N- sEV或等体积的PBS。相比对照组，circCDK13oe – sEVs处理的伤口愈合速度明显较快。研究团队通过H&E染色/Masson’s染色/WB/IF检测，结果表明，与N- sEV相比，circCDK13oe – sEVs在促进糖尿病创面愈合方面表现更好，主要表现为促进创面再上皮化、肉芽组织形成、胶原沉积以及毛囊和皮脂腺的再生。机制上，circCDK13oe – sEVs可能通过形成
circCDK13-IGF2BP3-CD44/c-MYC三元复合物促进CD44和c-MYC的表达，从而促进糖尿病创面愈合。（图6-7）
图6 circCDK13oe – sEVs加速db/db糖尿病小鼠的伤口愈合。
图7 circCDK13oe – sEVs促进STZ诱导的I型糖尿病大鼠的伤口愈合。
总结
综上所述，团队研究了糖尿病伤口延迟愈合的潜在机制。circCDK13通过m6A修饰依赖的方式与IGF2BP3相互作用，形成circCDK13- IGF2BP3-mRNA复合物，稳定CD44和c-MYC mRNA，并上调CD44和c-MYC的表达，促进HDFs和HEKs的增殖和迁移。此外，团队成功构建了含高丰度circCDK13的工程化sEV，并证实circCDK13oe – sEVs能促进糖尿病小鼠模型的伤口愈合。该研究表明，sev中递送circCDK13可能成为糖尿病创面治疗的新策略，circCDK13oe – sEVs作为一种有前景的糖尿病创面愈合的治疗策略，具有很大的临床应用潜力。