目前已有几种CAR-T细胞疗法被批准用于血液系统恶性肿瘤，且CAR-T疗法的研发已扩展到实体肿瘤和癌症以外的其他适应症[1, 2]。然而，临床应用中也存在一系列安全性问题，包括CD19或BCMA导向的CAR-T细胞治疗后，产生继发性T细胞恶性肿瘤的风险，这可能是CAR的转基因整合不准确造成的。FDA明确指出，所有使用整合载体的基因治疗产品中发生继发性恶性肿瘤的潜在风险被归类为一类警告[3]。除了存在危险的安全风险外，基于病毒载体制造CAR-T的CRS等副作用的发生率也相对较高。迫切需要一种更安全的CAR-T疗法，以最大限度地减少安全性问题，并对风险-收益平衡极为敏感的非癌性适应症中挖掘CAR-T细胞疗法的全部潜力。
mRNA疗法可避免传统CAR-T技术的病毒载体、基因组整合和永久转基因表达所带来的风险。然而，线性mRNA不稳定性，表达时间短，影响了基于mRNA的CAR-T的疗效。与线性mRNA相比，环状RNA（circRNA）的稳定性、较长的表达半衰期和较低的免疫原性在可能CAR-T治疗中具有优势。
2024年8月5日，复旦大学章旭耀研究员联合美国宾夕法尼亚大学华先欣教授在bioRxiv上发表文章：Scarless circular mRNA-based CAR-T cell therapy elicits superior anti-tumor efficacy。该研究基于PIE技术建立了量产、无痕的circRNA制备平台，以被批准应用的anti-CD19 CAR为例，构建了基于circRNA 表达anti-CD19 CAR的 T细胞，并从体外和体内验证了其作用效果。研究表明，相比线性mRNA，基于无痕circRNA的CAR-T细胞疗法具有更好的抗肿瘤效果和临床优势，可能成为CAR-T细胞疗法一个有前景的平台。
一、利用工程化PIE合成高产且无痕的circRNA
研究团队基于鱼腥藻tRNALeu基因建立了PIE平台，原理是将GOI的5’端（E2’）和3’端（E1’）功能化，分别作为经典PIE的E2和E1进行环化，产生无痕的circRNA，同时保留PIE高产率的优势。circRNA产物经过RNase R/Poly(A)聚合酶/RNase H/Sanger测序验证其环状结构及无痕序列，毛细管电泳定量检测出环化的circRNA约占90%。结果表明该PIE法合成的circRNA非常适合下游工艺，包括纯化和规模生产。团队将该方法命名为Hi-Scarless-PIE(高产无痕PIE)。（图1）
图1 利用基于PIE的工程化环化策略高效合成无痕环状RNA。
二、Hi-Scarless-PIE合成的circRNA在体外和体内稳定表达蛋白
Hi-Scarless-PIE合成编码GLuc的circRNA转染细胞系后，相比线性mRNA，蛋白表达水平明显更高且更稳定。LNP包封编码Fluc的circRNA肌肉注射到小鼠体内也能稳定有效地表达，持续14天。（图2）
图2 体外和体内合成无痕circRNAs稳定表达蛋白。
三、无痕circRNA在人原代T细胞中长效且高水平表达CD19 CAR蛋白
采用电穿孔法分别在T细胞中转染编码anti-CD19 CAR蛋白的circRNA和线性mRNA，得到anti-CD19 CAR-T细胞。结果发现线性mRNA的CAR表达水平在6h内达到峰值，1天后下降，第4天就检测不到；而circRNA组在转染后1天达到峰值，持续2天后下降，第7天检测不到，可见circRNA的表达更持久。PE标记的CD19蛋白孵育细胞，指示了相比线性mRNA，circRNA在细胞中anti-CD19 CAR蛋白的表达密度更高，也就是可能会有更强的细胞毒性。（图3）
图3 无痕circRNA增强和延长原代人T细胞上的CD19-CAR蛋白表达。
四、基于circRNA的anti-CD19 CAR-T细胞展现出对CD19+恶性细胞的有效杀伤活性
将基于线性mRNA和circRNA的anti-CD19 CAR-T细胞在转染后第一天和第四天分别与CD19+细胞系NALM-6和Raji按1:1、2:1和5:1的比例共培养16小时。结果显示，不同的共培养条件下，两组CAR-T细胞均能几乎完全裂解CD19+肿瘤细胞，而对CD19阴性细胞几乎无细胞毒性作用。而且，相比线性RNA组，circRNA组的细胞溶解率更高，即细胞毒性更大。（图4A-B）
五、相比线性mRNA的CAR-T（mCAR-T），circRNA的CAR-T（cmCAR-T）细胞因子释放增加
研究发现，基于线性mRNA和circRNA的CD19 CAR-T细胞均能释放大量IFN-γ、TNF-α（效应细胞功能的关键细胞因子）和IL-2（CAR-T细胞效力和持久性的标志），有剂量依赖性，而基于circRNA的CD19 CAR-T细胞释放的三种细胞因子水平更高。（图4C-E）
图4基于circRNA的anti-CD19 CAR-T细胞显示出强大的靶细胞杀伤活性，细胞因子释放增加。
六、mCAR-T和cmCAR-T细胞转录组学特征随时间的动态变化
不同方式产生的CAR-T细胞在患者中可能诱导不同的转录组学变化特征。研究团队通过RNA-seq分析，发现cmCAR-T的GZMB基因表达水平显著高于mCAR-T；而两种细胞都体现不同的共抑制基因PDCD1和TIGIT的表达和变化水平，PDCD1的绝对表达量明显低于TIGIT；两种CAR-T细胞的细胞毒性基因和T细胞激活标记表达都上调。DEG分析进一步比较两种细胞转录组，发现cmCAR-T细胞在第2天和第4天分别有113和232个DEG上调，这些DEG分别在细胞因子和干扰素信号通路中富集。总之，cmCAR-T和mCAR-T细胞中T细胞活化和细胞毒性信号通路可能是不同的，CAR-T功能信号在两种细胞中都是短暂的，但cmCAR-T比mCAR-T细胞具有更强效和长效的细胞毒性。（图5）
图5 转染后第2天和第4天，mCAR-T和cmCAR-T细胞的转录组学特征
七、基于cmCAR-T的anti-CD19 CAR-T细胞有效消除小鼠模型中NALM-6细胞
将两种CAR-T细胞分别通过尾静脉注射到小鼠体内，第一天检测到mCAR-T细胞比例为40%，而cmCAR-T细胞比例超过80%；第三天mCAR-T细胞减少到20%，cmCAR-T细胞保持50%以上。这表明基于cmCAR-T的anti-CD19 CAR-T细胞在体内表现出更持久的活性。与低剂量方案相比，高剂量治疗显示出更有效的肿瘤清除。（图6）
图6 基于cmRNA的anti-CD19 CAR-T细胞在体内消除NALM-6细胞。
八、基于cmRNA的anti-CD19 CAR-T细胞在体内激发了强大的抗肿瘤功效
为验证mCAR-T和cmCAR-T细胞的可行性和有效性，研究团队在NALM-6肿瘤模型进行了验证。结果发现相比线性mCAR-T处理组，cmCAR-T细胞处理组小鼠负荷肿瘤明显更小，体重更稳定，且存活时间更长，12天后记忆T细胞比例明显更高。这表明基于circRNA的anti-CD19 CAR-T细胞在体内可有效清除NALM-6细胞，且具有持续的抗肿瘤效果。（图7）
图7 在体内，基于cmRNA的CAR-T细胞在消除靶细胞方面优于线性mRNA的CAR-T细胞。
总结
该研究通过PIE平台设计合成了高产、无痕的circRNA，用于有效的CAR表达和持久的CAR- T疗效。与线性mRNA相比，基于circRNA的anti-CD19 CAR-T细胞具有优越的抗肿瘤功效，从体外特异性细胞、细胞因子释放、转录组学模式和体内肿瘤消除等多个角度验证了cmCAR-T细胞治疗的优越性。
体外基于mRNA的CAR-T细胞已经在早期临床试验中进行了长时间的测试，随着靶向LNP递送系统的进展，陆续出现体内CAR-T的研究：通过靶向递送CAR编码mRNA到体内T细胞中，在人体内产生CAR-T细胞。前段时间，复旦大学璩良团队[4]也阐述了递送编码circRNA在体内表达CAR的疗法。随着未来靶向T细胞递送系统的发展，利用circRNA表达CAR蛋白的体内CAR疗法优势将充分体现，有望成为开发下一代CAR-T疗法。
参考文献
[1] Baker, D. J. et al. CAR T therapy beyond cancer: the evolution of a living drug. Nature 619, 707-715, doi:10.1038/s41586-023-06243-w (2023).
[2] Labanieh, L. & Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next
generation. Nature 614, 635-648, doi:10.1038/s41586-023-05707-3 (2023).
[3] Zhu, Z. et al. mRNA-Engineered CD5-CAR-γδTCD5- Cells for the Immunotherapy of T-Cell
Acute Lymphoblastic Leukemia. Adv Sci, e2400024. doi: 10.1002/advs.202400024. (2024).
[4] Liang Q. et al. Synergically enhanced anti-tumor immunity of in vivo CAR by circRNA vaccine boosting. bioRxiv。(2024)