circRNA的细胞内表达效率和生物安全性受合成过程中产生的RNA副产物影响。RNase R (RR)广泛应用于去除circRNA的线性副产物。然而，高度结构化的RNA，特别是那些具有双链区域和稳定二级结构的RNA，可以抵抗RNase R的降解。污染物增加了生产成本和时间，阻碍了circRNA大规模生产和广泛使用的潜力。因此，需要一种能够有效消除激活免疫反应污染物的优化的纯化策略。
2024年9月21日，中国科学院纳米生物效应与安全性重点实验室曹宇虹研究员团队在bioRxiv上发表研究论文：Mitigating Cellular Dysfunction by Addressing Contaminants in Synthetic circRNA。研究对circRNA合成过程中RNA 副产物的免疫原性进行了全面分析，并为减轻合成环状RNA的免疫原性，究开发了一种结合纤维素过滤和酶处理的逐步纯化策略。这种新的纯化方法不仅可以减轻免疫应答，还可以增强circRNA的表达，显著提高生产效率。
一、体外合成circRNA的副产物显著触发先天免疫反应
研究利用I型内含子自剪接法合成circ-eGFP。尺寸排除色谱法（SEC）将未纯化的circ-eGFP分离成3种不同组分：高分子量副产物组分（HMW，dsRNA和其它RNA聚合物）、主组分（circRNA、nicked RNA、线性RNA前体）、内含子。研究将不同分离组分或未纯化的circRNA转染到PMA分化的THP-1细胞中，然后进行转录组分析、RT-qPCR验证及细胞因子检测，结果发现，未纯化的circ-eGFP和HMW组分免疫原性最高，这表明存在多种RNA杂质，可以激活多种RNA传感器；内含子部分的免疫原性相对较低。（图1-2）
图1 由IVT合成的环状RNA副产物激活先天免疫
图2 RNA测序显示IVT circRNA免疫原性最高
二、去除dsRNA是提高circRNA性能的关键
微量的HMW杂质就会对circRNA 的功能产生不利影响，因此研究利用微晶纤维素（MCC）色谱法去除不利于circRNA功能的HMW杂质，并毛细管电泳分析各种峰的组分。HeLa细胞验证对各组分功能，结果表明，内含子峰的组分显著提高了转染和蛋白表达效率，HMW峰组分的表达效率则降低或没有提高，这进一步强调了HMW杂质与蛋白质表达效率呈强烈的负相关，对circRNA功能产生严重负面影响。（图3）
图3 去除dsRNA可显著提高circRNA的可翻译性。
三、酶处理对于提高circRNA纯度和降低免疫原性至关重要
去除dsRNA可以很大程度上提高circ-eGFP的可翻译性。然而，其他污染物，如线性杂质或内含子也可以刺激免疫反应并降低circRNA的表达效率。RR处理有效地消除了大部分线性RNA，处理后circ-eGFP纯度约为89.8%。然后，SEC分离各组分分别转染至A549细胞，含有dsRNA的RR+circ-eGFP和HMW组分仍诱导了的先天免疫反应，其中主组分的反应较小，内含子组分体现了中度的免疫原性。（图4）
研究利用磷酸酶处理不同组分，以去除已知触发免疫传感器(如RIG-I)的5 ‘三磷酸基团。A549细胞验证结果表明，虽然磷酸酶处理降低了内含子来源杂质的免疫原性，但几乎没有减轻HMW组分（主要含有dsRNA）引起的免疫反应。磷酸酶消化后的主要组分也表现出较低的免疫原性。转录组测序、KEGG和GO及RT-qPCR结果显示，磷酸酶处理后，RNA传感器分子和细胞因子的mRNA水平下降。（图4）
图4 RNase R和磷酸酶纯化IVT产生的circRNA
四、联合纯化策略去除免疫原性副产物
联合MCC纯化、RR和磷酸酶法（RR+ MCP）逐步纯化的circ-eGFP，免疫原性与SEC和酶处理常规法得到的超纯circ-eGFP相当，都可以有效纯化IVT circRNA，有效减轻免疫反应。此外，联合MCC纯化、RR和磷酸酶法可产生高纯度的circRNA制剂。（图5-6）
图5 MCC层析与酶处理联合降低免疫原性并增强蛋白表达。
图6 RNA测序显示，酶处理和MCC层析纯化的环状RNA免疫原性较低。
五、WMC色谱纯化circRNA，最大限度减少先天免疫反应
为进一步提高纯化效率，研究引入了天然多孔材料木源大孔纤维素(WMC)以去除dsRNA。WMC的多孔性质从circRNA中有效去除不同长度的dsRNA，同时保持目标RNA的高回收率。优化的纯化过程:(1)RR处理消除前体RNA；(2) WMC层析去除残留的dsRNA；(3) 磷酸酶处理消除可能残留的磷酸基团。新策略纯化IVT circRNA，可完全去除dsRNA。与RR+SEC纯化法相比，WMC色谱法的回收率明显更高(> 70%)，纯度约95%；提高的翻译效率，以及显著降低的免疫原性与超纯circRNA相似。总之，使用WMC逐步去除副产物的策略是一种高效的纯化工具，可以生产出高产量、高纯度、低免疫原性的环状RNA，有望用于治疗应用。（图7）
图7 优化WMC色谱法高效纯化circRNA。
总结
合成环状RNA (circRNA)在生物医学研究和疗法中显示出巨大的潜力，但在合成过程中引入的杂质会破坏circRNA的疗效。该研究阐述了circRNA合成过程中产生的副产物可通过参与RNA感知分子激活先天免疫反应，显著影响circRNA的功能。
为解决这个问题，研究团队开发了一种新的多步骤净化工艺，采用酶处理和纤维素基过滤选择性地去除这些有害污染物。这种定制的方法最大限度地减少了细胞免疫反应，并大大提高了circRNA的产量，最高可提高10倍以上。研究结果强调了有效的污染物去除，在增强circRNA的表达和潜在治疗效用方面的关键影响。这为研究和临床应用中circRNA的优化生产提供了新的方向。