那么，RNA，尤其是构象更复杂的circRNA的结构预测和设计又将何去何从呢？是任重道远还是方兴未艾？
2024年10月3日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心陈玲玲研究员受邀在国际学术期刊Molecular Cell上发表了题为“Dynamic conformation: Marching toward circular RNA function and application”的综述论文。分子细胞卓越中心副研究员刘楚霄为该论文的第一作者，该项工作还得到复旦大学生物医学研究院/复旦大学附属儿科医院杨力研究员的大力支持。
该论文阐明环状RNA的动态折叠规律，总结了环状RNA折叠结构对生物学功能与生物医学应用的影响，梳理了环状RNA折叠结构研究的技术手段及现存瓶颈，讨论了研究环状RNA构象的研究意义以及进一步解决其构象研究的剩余技术问题，这些信息将为基于环状RNA的生物医学技术发展提供创新方案。
1. 环状RNA作用模式取决于构象
环状RNA的共价闭合构象可以调节其功能和生命周期。反向剪接发生的效率很低，因而大多数环状RNA的表达丰度较低，这可能会限制其的功能。然而，环状结构使环状RNA可对抗核外降解，可能会导致比线性同源物更高的表达。（图1）
1.1 环状RNA构象调节其生命周期
转录物的稳定状态下生物发生和降解之间是平衡的，细胞中必须存在一定机制确保circRNA被适当地去除，这可能依赖于circRNA的构象。microRNA (miRNA，另一位2024年诺奖赢家）可靶向环状RNA互作，介导Argonaute 2 (AGO2)切割RNA；折叠强度可能限制被环状RNA靶位点可及性，或抑制AGO2及其它组分向miRNA诱导的沉默复合体募集。m6A是一种可逆的转录后修饰，可影响RNA折叠和蛋白质结合，也可能影响circRNA折叠和降解。部分高度结构化的环状RNA可被ATP依赖的UPF1及其相关的核酸内切酶Ras-GTPase激活的G3BP1识别和切割。
图1 环状RNA的作用模式取决于它们的构象。
1.2 circRNA构象与先天免疫调节有关
水疱性口炎病毒(VSV)感染期间，与环状RNA形成有关的NF90/NF110核输出，下调环状RNA生成，可见环状RNA不利于先天免疫应答的激活。[1]先天免疫dsRNA激活的蛋白激酶R (PKR)可被长dsRNA激活，而短dsRNA可阻碍其激活。[2]ds-cRNAs与dsRBP的结合具有选择性，如ds-cRNAs对ADAR1-p150有独特结合偏好，但这是否与ADAR1-p150特异性免疫病理有关仍有待研究。[3]
1.3 CircRNA的构象与其细胞功能有关
几种丰度较高的环状RNA可采用不同的构象与特定蛋白质结合以实现细胞功能。
① circRNA可作为cGAMP合成酶(cGAS)的诱饵，结合能力甚至强于自身DNA。[4]
② 脂肪性肝炎相关的circRNA ATP5B调节剂(SCAR)可形成功能性circRNA-蛋白(circRNP)复合物，抑制非酒精性脂肪性肝炎中线粒体活性氧(mROS)的产生。(图1E)[5]
③ circZNF609可通过环化位点序列直接与细胞骨架相关蛋白5 (CKAP5) mRNA结合，促进人抗原R (HuR)结合，提高CKAP5 mRNA的稳定性和翻译能力。[6]
1.4 环状RNA构象调节翻译
内源性环状RNA可利用IRES或以m6A依赖的方式进行翻译。环状IRES可比线性的更具结构性，且位于IRES上的茎环结构RNA元件(SuRE)可促进环状RNA的翻译。[7]
2. 影响环状RNA构象的因素
环状RNA研究的一个挑战是：除了特征性的环化位点，整个序列与其线性同源物重叠。因此，跨环化位点的序列经常用于功能丧失和其他研究。但这些方法可能并不有效，因为具有环化位点结构的环状RNA可能由于低效退火而无法被反义探针或其他方法识别。影响环状RNA构象的因素，包括导致特有结构产生的共价闭合效应、影响circRNA定位和功能RBP结合、影响分子内碱基配对的序列长短和稳定结构或排斥dsRNA形成的碱基修饰（如m6A）。
3.分解或重现环状RNA构象的方法
环状RNA的折叠方式可能与线性RNA不同，再现和分析环状RNA构象仍然具有挑战性，迫切需要新的技术进步。环状RNA折叠预测常用的方法是计算机模拟和化学探测。（图2）
计算机模拟如ViennaRNA的RNAfold、MFold等，化学探针法如SHAPE-MaP都依赖于定义明确的自由能最小化规则来计算和概括环状RNA折叠的可能性。但目前分析的分析方法很难区分环状RNA中折叠状态的改变。因此，需要开发新的跨学科方法研究环状RNA结构，解决线性RNA训练的自由能最小化规则的问题。
蛋白质结构预测的准确性越来越高，但从RNA序列预测RNA结构的通用模型还落后，环状RNA更是如此，这是因为RNA的高度动态性以及缺乏实验确定的二级或三级RNA结构的数据。大规模化学图谱实验数据、单核苷酸分辨率的分子内RNA-RNA相互作用数据，以及可以克服自由能最小化的机器学习模型的发展，可能为环状RNA构象建模提供新的视角。
图2 环状RNA构象预测的现有和未来方法。
4. 合适的构象满足环状RNA制备平台
由于环状RNA天然的高稳定性、独特的构象和低免疫原性可以调节细胞的进程，新兴的研究已经开始研发基于环状RNA技术的治疗方式。环状RNA构象在调节其生命周期和功能方面至关重要，在设计和应用基于环状RNA的翻译平台时，研究其折叠状态是非常有必要的。（图3）
4.1 细胞和体外生成环状RNA
环状RNA可在细胞中通过含有可环化外显子的异位载体表达，这些外显子具有天然的内含子序列或在侧翼内含子中设计互补序列。另一种策略是tornado(Twister优化的RNA,用于持久的过表达)表达系统，在环化位点引入了一个47nt的外来片段体外合成环状RNA。
4.2 环状RNA构象影响免疫原性
传统PIE方法引入了180 nt的外来片段，包括附加的间隔序列和标准的外显子末端片段，可形成长而不完全配对的双链，可引起先天免疫反应。
考虑潜在的免疫原性是很重要的，包括在设计RNA环时控制环状RNA折叠状态的因素和规则，且应该注意可能影响环状RNA构象的环化位点和引入外来序列。
4.3 设计的环状RNA适体中的RNA构象
适配体是细胞中的短结构DNA和RNA，可结合特定的靶标，从而操纵细胞内的过程。由于RNA对RNA酶的易感性，RNA适配体的开发面临着巨大的挑战，但环状RNA的高稳定性和独特的构象赋予了它们巨大的适配体潜力。
4.4 设计可翻译环状RNA的构象
具有翻译能力的环状RNA可发展成为基于mRNA有前景的疗法。不少研究致力于合理设计和优化环状RNA的合成，以提高其翻译能力。然而，IRES的选择、环状RNA折叠规则、翻译起始和延伸动力学、组织或细胞类型特异性翻译效率以及翻译异质性等多种因素，都可影响IRES依赖的环状RNA翻译。
因此，有必要进一步优化circRNA设计合成平台：改进IRES的编码潜能、构象和免疫原性的设计，包括开发新的系统解析环状RNA翻译的起始和延伸，设计合适的IRES以有效招募翻译起始复合物，设计化学拓扑介导的帽依赖翻译代替IRES；开发高置信度结构预测工具包以改进现有的基于线性RNA结构预测的算法。这可优化环状RNA的IRES折叠，以最大限度减少由结构IRES或PIE合成过程中意外引入的长双链或扭曲结构引发的毒性。
4.3 设计的环状RNA适体中的RNA构象
适配体是细胞中的短结构DNA和RNA，可结合特定的靶标，从而操纵细胞内的过程。由于RNA对RNA酶的易感性，RNA适配体的开发面临着巨大的挑战，但环状RNA的高稳定性和独特的构象赋予了它们巨大的适配体潜力。
图3 理解环状RNA的构象有利于环状RNA的设计和应用。
吉赛生物利用circRNA的二级结构，自主研发建立基于T4 Rnl 2连接法的circPure®RNA，以及基于I型内含子自剪接法的circPrecise®RNA环化专利技术。
基于T4 Rnl 2连接法的circPure®RNA针对目标RNA序列，先模拟成环后的二级结构，根据二级结构设计断开位点，使断开位点附近形成数个碱基对。以设计的序列作为模板，采用T4 Rnl 2直接进行连接。连接过程中，线性RNA连接位点附近形成RNA双链结构，极大提高了T4 Rnl 2的反应效率；且二级结构的形成使连接末端靠近，减少了分子间副反应的产生。该技术无需借助夹板链或辅助链，降低了后续纯化工艺的难度；成环的过程当中大分子副产物的产生被显著抑制，从而实现高品质目的环状RNA的高效制备。
基于PIE法的circPrecise®RNA环化专利技术通过对目标线性RNA核酸序列进行再设计，选择适合内含子自剪切核酶进行精准剪切的位点，并对鱼腥藻内含子自剪切核酶中外显子序列的去除，无引入多余序列，避免外来序列导致的免疫原性，实现了RNA体外转录No Scar的精准高效环化。
总结
环状RNA的构象及其与同源线性RNA的序列重叠给其功能研究和应用发展带来了挑战。然而，环状RNA共价闭合特性赋予了环状RNA高稳定性、低免疫原性和独特的折叠特性，为开发基于环状RNA的技术和治疗方法提供了巨大的潜力。环状RNA构象是其稳定性和免疫原性的核心，更好地理解和解决复杂的环状RNA折叠将推动该领域的发展。
体外合成环状RNA需要考虑几点：
① 选择特定的环化方法时，要考虑环化目标序列的大小。PIE法可产生更长的环状RNA。
② 仍很难预测环状RNA的折叠状态，这是细胞功能和潜在应用的关键，包括作为有效的适配体和基因表达平台。因此，建议在设计环状RNA之前进行化学探针辅助环状RNA构象检查。
③ 环状RNA的不同合成策略与不同的递送公式和方法可能改变RNA的折叠状态，导致不同的结果。
解决环状RNA构象的技术问题无疑将加速我们对其功能的理解，并有助于设计基于环状RNA的生物医学应用平台。
原文链接
https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(24)00697-X?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS109727652400697X%3Fshowall%3Dtrue
参考文献
[1] Li, X., et al. (2017). Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Mol. Cell 67, 214–227.e7.
[2] Liu, C.X., et al. (2019). Structure and Degradation of Circular RNAs Regulate PKR Activation in Innate Immunity. Cell 177, 865–880.e21.
[3] Zhang, S.Y., et al. (2018). Inborn Errors of RNA Lariat Metabolism in Humans with Brainstem Viral Infection. Cell 172, 952–965.e18.
[4] Xia, P., et al.(2018). A Circular RNA Protects Dormant Hematopoietic Stem Cells from DNA Sensor cGAS-Mediated Exhaustion. Immunity 48, 688-701.e7.
[5] Zhao, Q., et al. (2020). Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output. Cell 183, 76–93.e22.
[6] Rossi, F., et al. (2022). Circular RNA ZNF609/CKAP5 mRNA interaction regulates microtubule dynamics and tumorigenicity. Mol. Cell 82, 75–89.e9.
Chen, C.K., et al. (2021). Structured elements drive extensive circular RNA translation. Mol. Cell 81, 4300–4318.e13.