该研究发现circPIAS1能翻译长为108个氨基酸的新多肽（circPIAS1-108aa），在人和小鼠细胞中均天然存在，且序列具有较高的保守性。CircPIAS1-108aa能干扰STAT1的SUMO-磷酸化平衡，抑制ICB诱导的恶性黑色素瘤（恶黑）免疫原性铁死亡；这一机制不依赖circPIAS1的传统海绵机制或RNA-生物大分子的相互作用。
因此抑制circPIAS1或circPIAS1-108aa并联合ICB，有望为克服恶黑免疫耐受提供新的治疗策略。
背景
黑色素瘤是由黑色素细胞癌变产生，具有极高的恶性程度，转移性和致死率，近年来它已经成为发病率增长最快的癌症之一，严重危害着世界各地人民的生命安全。现如今，临床上主要采用免疫检查点阻断（ICB）疗法治疗黑色素瘤，比如靶向PD-1/PD-L1的抑制剂，能阻断癌细胞对T细胞的屏蔽作用，进而激活T细胞形成CD8+ T以释放大量干扰素γ（IFNγ），抑制下游SLC7A11/GPX4信号转导通路，从而诱发免疫原性铁死亡。但不幸的是，半数以上的患者在经ICB治疗后，病情仍无明显改善，甚至对药物基本没有响应。那么黑色素瘤内是否存在某种关键因子维持肿瘤的发展并阻碍免疫检查点抑制剂的起效，是一个仍然未知又亟待解决的问题。
Circular non-coding RNAs（circRNAs）是一类调节型非编码RNA，由mRNA前体（pre-mRNA）反向剪切形成，具有环状共价闭合结构，可耐受RNA酶的降解，为其在体内稳定发挥功能提供保障。CircRNA在疾病的发生和发展中承担了许多重要角色，尤其在癌症领域中起到了十分关键的调控作用。最新研究表明，即使circRNA被定义为非编码RNA，却仍有少部分具备编码蛋白质的能力，由它们编码的多肽也被证实是影响肿瘤进展的关键因子。
因此，该研究致力于寻找一种由circRNA编码的特殊多肽，它作为关键因子阻碍免疫药物的起效，对增强ICB药物治疗恶性黑色素瘤效果有着重要意义
亮点
1. CircPIAS1能够编码长108 aa（circPIAS1-108aa）的新型多肽，是促进恶性黑色素瘤进展的关键因子；
2. CircPIAS1-108aa通过增强STAT1的SUMOylation，以阻断IFNγ对STAT1的磷酸化激活，从而阻碍ICB药物起效；
3. 解释了ICB药物抗部分恶行黑色素瘤效果不佳的原因；
4. 为恶性黑色素瘤治疗提供了关键切入点，也为ICB药物增效提供了新思路。
研究内容
1. CircPIAS1在黑色素瘤中高表达并促进癌症进展
夏元铮副教授团队基于前期研究，使用RNA-seq和Ribo-seq分析了单独使用PD-1 抑制剂或与脂质体药物联合给药的C57 BL/6J小鼠的肿瘤组织（图 1a）。在已确定的具有蛋白编码潜力的circRNA中，发现有17个候选基因在PD-1抑制剂单独治疗时上调，而在联合治疗时下调。利用IRESfinder程序评估了这17个circRNA的内部核糖体进入位点（IRES）区域活性，并进一步用差异指数进行了分析（图 1b）。结果显示，与PD-1抑制剂单药治疗相比，联合治疗后mmu_circ_0015773明显下调，表明circPIAS1可能是促进黑色素瘤生长和阻碍免疫药物疗效的重要因素。
该mmu_circ_0015773是由 Pias1 的第 3 至 6 号外显子反向剪接生成的，与人类的hsa_circ_0008378相对应，两者序列高度保守为94.71%（图 1c-d）。CircRNA与线性非编码RNA不同，后者是由pre-mRNA的反向剪切环化产生的。为了区分其同源线性host基因和circPIAS1，研究人员设计了线性宿主基因的正向引物，并正对成环位点附件设计了circPIAS1的发散引物。对gDNA和cDNA的PCR实验证实了人和小鼠黑色素瘤细胞中存在circPIAS1（图 1e）。此外，RNase R外切酶耐受实验也提供了额外的证据（图 1f-g）。FISH实验显示，circPIAS1主要定位于细胞核（图1h）。对患者组织的FISH实验表明，与邻近组织相比，黑色素瘤中的circPIAS1水平显著升高（图 1i）。
为了进一步研究circPIAS1的促癌作用，研究者开发了针对circPIAS1成环位点的特异性ASO序列。ASO-circ-1/3能有效降低circPIAS1的表达，而不影响线性宿主基因PIAS1的水平。CCK8、克隆形成和EdU实验均表明，circPIAS1敲低后黑色素瘤细胞增殖受到显著抑制，这说明circPIAS1在促进了黑色素瘤进展。
图1 circPIAS1发现与验证
2. CircPIAS1的促/致癌作用依赖于其编码的特定多肽circPIAS1-108aa
根据数据库预测，无论是mmu_circ_0015773还是hsa_circ_0008378，都含有高活性的IRES序列，均可以翻译出由108个氨基酸组成的特殊多肽（研究人员在其论文中，命名为circPIAS1-108aa）（图 2a）。通过双荧光素酶报告实验，研究人员确定了小鼠和人 circPIAS1 的核心IRES 序列，分别位于81-254 bp和21-194 bp处（图 2b-c）。随后的分子生物学探索发现，IRES主要活性区集中在后半部（图 2d-e）。
为了验证 circPIAS1-108aa的存在，研究人员使用高精度 LC-MS/MS 分析了小鼠和人类黑色素瘤细胞中的内源性蛋白质。成功鉴定了circPIAS1-108aa的多个肽段，包括其羧基端特异性16 aa（图2f）。针对circPIAS1-108aa特异性尾部研究人员设计了多克隆抗体（图2g-h）。
图2 circPIAS1-108aa蛋白的检测
为了探索circPIAS1在促进黑色素瘤增殖中的作用是否依赖于circPIAS1-108aa，研究人员将两组过表达质粒：（1）circ-control、circPIAS1、circPIAS1-ATG-mut和（2）linear-control、linear-ORF-108aa分别进行转染，qRT-PCR和Western Blot实验分别证实了它们在RNA和蛋白质水平的过表达（图2g和3a）。CircPIAS1-ATG-mut 与 circPIAS1 质粒不同，前者转染到癌细胞后不能产生特异性蛋白，只能在 RNA 水平上调。表型实验证明，只有当 circPIAS1-108aa 蛋白水平升高时，黑色素瘤的增殖才会增强（图 3b-f）。这一结果也同样获得临床队列研究的支持（图3g-h）。这些实验证实了 circPIAS1 的致癌功能依赖于其编码的特殊多肽，而非其传统海绵机制或RNA与生物大分子间的相互作用。
图3 circPIAS1-108aa促进恶黑增殖
3. CircPIAS1-108aa通过抑制STAT1磷酸化激活SLC7A11/GPX4通路，从而避免黑色素瘤细胞发生铁死亡
众所周知，PIAS1是STAT1的特异性抑制剂，可阻止p-STAT1二聚体的形成及随后的下游信号通路。因此，推测circPIAS1可能与STAT1密切相关。通过Western Blot，研究人员发现敲低或过表达circPIAS1后STAT1及其下游SLC7A11/GPX4信号级联的变化（图 4a-b）。有趣的是，circPIAS1-108aa并未改变STAT1的总蛋白水平，但明显抑制了其磷酸化。此外，circPIAS1-108aa还对SLC7A11和GPX4起了正向调节作用。SLC7A11/GPX4轴是STAT1的一个重要下游靶标，主要参与GSH的转运和细胞膜脂质过氧化物的清除，以减轻氧化损伤并保护细胞免受铁死亡。该研究利用C11-BODIPY探针直接测量癌细胞膜上的脂质过氧化损伤。结果表明，circPIAS1-108aa能有效减少氧化损伤，保护癌细胞免于铁死亡（图 4c）。此外，GSH和MDA水平的检测证实，circPIAS1-108aa激活了SLC7A11/GPX4级联，导致GSH增加和MDA降低（图4d和4e）。
为了进一步研究circPIAS1-108aa是否通过直接影响铁死亡或其他形式的细胞死亡来促进癌症进展，研究人员利用铁死亡诱导剂和抑制剂进行试验。结果表明，在 ASO-circPIAS1的存在下，铁死亡诱导剂Erastin的抗肿瘤效果明显增强，而铁死亡抑制剂Ferrostatin-1的肿瘤保护作用则明显降低。同时，敲降circPIAS1并未导致细胞周期发生明显变化。
患者组织免疫组化实验也证实，与正常组织相比，肿瘤组织中circPIAS1的水平明显更高（图 4f）。此外，在肿瘤组织中，circPIAS1的表达与p-STAT1呈负相关，与GPX4呈正相关（图4g-i）。
图4 circPIAS1-108aa抑制恶黑铁死亡
4. CircPIAS1-108aa可阻碍INFγ诱导的黑色素瘤铁死亡
最近的研究表明，用ICB治疗后，活化的CD8+ T细胞会产生高水平的IFNγ，进而促进STAT1磷酸化，抑制SLC7A11/GPX4信号通路，诱导黑色素瘤中的铁死亡。有趣的是，研究人员发现，circPIAS1-108aa阻断了这些信号通路并防止了铁死亡，这表明circPIAS1-108aa可能通过抑制这一特定通路来抵消IFNγ的影响（图5a-b）。
降低circPIAS1-108aa的水平会增强IFNγ对STAT1的磷酸化，并提升对SLC7A11/GPX4轴的抑制。相反，上调circPIAS1-108aa可以显著逆转IFNγ对STAT1磷酸化的激活，从而恢复SLC7A11和GPX4的水平。这些结果在GSH和MDA实验中同样获得验证（图 5c-d）。
此外，通过检测C11-BODIPY标记的细胞膜，观察到IFNγ与ASO-circPIAS1联合使用会促进氧化损伤，而IFNγ与circPIAS1过表达联合则会减少氧化损伤（图5e）。此外，多种表型实验也证明，circPIAS1的存在明显阻碍了IFNγ的作用（图 5f）。
这些发现说明circPIAS1-108aa能通过抑制STAT1的磷酸化，以限制IFNγ对黑色素瘤的杀伤。
图5 circPIAS1-108aa阻碍INFγ诱导的黑色素瘤铁死亡
5. CircPIAS1-108aa可以调控STAT1的SUMOylation和磷酸化修饰间的平衡
CircPIAS1-108aa的前92个氨基酸来源于（宿主基因编码）蛋白 PIAS1 的 PINIT 结构域的连续序列，这一结构域是调控PIAS1核定位的关键区域。免疫荧光实验表明，敲降circPIAS1后，PIAS1的核定位并未受到干扰。此外，敲降PIAS1后，STAT1磷酸化水平也没有发生改变，这意味着circPIAS1-108aa对STAT1磷酸化的抑制并不依赖于PIAS1。此外，无论PIAS1是否被敲降，过表达circPIAS1都能显著抑制STAT1的磷酸化。因此说明，circPIAS1-108aa对STAT1磷酸化的抑制作用与PIAS1无关。
STAT1磷酸化受激酶和磷酸酶等多种因子调控，研究人员采用IP-MS技术研究circPIAS1-108aa是否通过招募特定因子来影响这一过程（图 6a）。有趣的是，circPIAS1-108aa没有招募任何激酶或磷酸酶，而是与SUMO E3连接酶Ranbp2 紧密结合（图 6b）。IP结果证实circPIAS1-108aa的确有效地招募了Ranbp2（图 6c）。此外，还观察到circPIAS1-108aa和Ranbp2共同定位在细胞核中，为它们的相互作用创造了有利的空间条件（图 6d）。先前的研究表明，Ranbp2的增多可增强STAT1的SUMOylation，从而抑制STAT1在Tyr701的磷酸化。基于此，研究人员假设circPIAS1-108aa通过招募Ranbp2增强STAT1 SUMOylation，从而阻碍STAT1磷酸化。Western Blot结果表明，过表达circPIAS1同时抑制Ranbp2可使p-STAT1恢复到其基础水平（图 6e）。
为了深入研究circPIAS1-108aa对增强STAT1 SUMO的影响，将STAT1-Flag、SUMO1-His和circPIAS1过表达质粒转染到细胞中。结果表明，circPIAS1-108aa显著促进了STAT1的SUMO，抑制了STAT1的磷酸化（图 6f）。此外，突变实验（图 6g）证明，STAT1中Tyr701处的磷酸化主要受Lys703和Glu705处SUMO的影响。在野生型STAT1中，circPIAS1促进了SUMOylation，阻碍了磷酸化，而在突变型中则未有此现象（图 6h）。这些发现为 circPIAS1-108aa 通过招募 Ranbp2 增强STAT1的SUMOylation以抑制STAT1磷酸化提供了证据。
图6 circPIAS1-108aa干扰STAT1 SUMO-磷酸化平衡
6. 下调circPIAS1-108aa可以显著提升PD-1的抗黑色素瘤效果
为了进一步研究circPIAS1在黑色素瘤中的作用及其作为治疗靶点的潜力，研究人员在C57 BL/6J小鼠中建立了黑色素瘤皮下接种模型，然后给予不同处理（图 7a）。特异性ASO用于靶向并敲降circPIAS1。PD-1抑制剂和其特异性IgG阴性对照用于评估ASO-circPIAS1对ICB疗法的影响。动物实验结果表明，小鼠的健康状况（包括体重和组织）未受到治疗的干扰（图 7b）。此外，在单独使用ASO-circPIAS1或PD-1抑制剂后，肿瘤体积一定程度缩小，联合治疗的抑制效果最明显（图 7c-d）。这些研究结果表明，circPIAS1抑制剂与PD-1抑制剂联用可显著提高免疫药物的疗效，也体现了circPIAS1在限制ICB药物杀伤肿瘤效果方面的作用。
为了进一步验证circPIAS1是否能通过抑制STAT1磷酸化过程来减轻免疫原性铁死亡，研究人员对肿瘤组织进行了IHC染色分析（图7e）。与单一用药相比，ASO-circPIAS1和PD-1抑制剂联合用药会导致p-STAT1水平显著升高，而GPX4水平则呈现相反的趋势。此外，Western Blot可重复小鼠肿瘤组织中上述IHC检测蛋白水平的变化（图 7f）。以往的研究表明，发生铁铁死亡的癌细胞会改变免疫微环境，增强肿瘤免疫浸润。因此，研究人员还评估了肿瘤组织中的铁死亡程度和免疫微环境（图 7e）。结果显示，联合治疗后，癌细胞中的铁死亡明显增强，免疫环境中的CD8+ T细胞和IFNγ水平显著升高。
图7 circPIAS1 ASO药物增敏ICB治疗
总之，circPIAS1-108aa显著阻碍了免疫药物的疗效。使用ASOs敲降circPIAS1可显著提升PD-1抑制剂的抗黑色素瘤效果，而不会对宿主造成额外伤害。这些研究结果表明，下调/抑制circPIAS1或其编码的蛋白circPIAS1-108aa可增强免疫检查点阻断疗法的疗效，为改善临床黑色素瘤免疫疗法提供了一种新策略。
机制总结图
原文链接：
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-024-02124-6