寨卡病毒（ZIKV）与登革热病毒（DENV）在地理分布上有重叠，且两者都属于黄病毒科。ZIKV感染与严重的神经系统疾病有关，包括吉兰-巴雷综合征和新生儿小头症。
抗体依赖性增强（ADE）是寨卡病毒（ZIKV）疫苗开发的一个潜在问题。交叉反应而中和性差的抗体通常靶向病毒膜前或包膜(E)蛋白，这可潜在增强登革热病毒（DENV）感染。虽然E结构域III （EDIII）含有寨卡病毒特异性表位，但其免疫原性较差。由于ZIKV和DENV之间的交叉反应性，ZIKV疫苗的开发需要特别注意避免增强DENV感染的ADE效应。
2024年10月16日，中国科学院广州生物医药与健康研究院冯立强研究员、巫林平研究员和陈凌教授在Nature Communications期刊上发表论文：A single-dose circular RNA vaccine prevents Zika virus infection without enhancing dengue severity in mice。研究基于环状RNA（circRNA）开发疫苗，用于预防ZIKV感染，且不增强 DENV的严重性。
该研究表明，与编码单体或三聚体EDIII的circRNA相比，编码融合人IgG1 Fc片段（EDIII-Fc）的二聚体EDIII的circRNA诱导了更好的生发中心反应和更高中和活性的抗体。在免疫C57BL/6小鼠和干扰素α/β受体敲除的成年C57BL/6小鼠中，两剂编码EDIII-Fc和寨卡病毒非结构蛋白NS1（另一种保护性抗原）的circRNA可预防新生儿寨卡病毒的致命感染。重要的是，单剂量优化的circRNA疫苗可改善抗原表达，在小鼠中具有有效和持久的保护作用，而不会诱导明显的DENV ADE，这为基于编码EDIII-Fc和NS1的circRNA开发黄病毒疫苗奠定了基础。
一、EDIII-Fc circRNA具有优于EDIII-Fd或EDIII circRNA的免疫原性
研究设计了三种候选circRNA疫苗，分别编码ZIKV的E蛋白域III（EDIII）的单体、二聚体（与人类IgG1 Fc片段融合，称为EDIII-Fc）和三聚体（与T4噬菌体纤维蛋白的foldon结构域融合，称为EDIII-Fd）。
研究利用鱼腥藻 pre-tRNA（Ana）衍生的Ⅰ型内含子自剪接（PIE）法体外合成circRNA，环化效率超过95%，然后经过HPLC纯化及RNase R处理；将候选疫苗分别转染到HEK293T细胞，验证了EDIII、EDIII-Fc和EDIII-Fd在细胞裂解物中表达相当，而EDIII的分泌效率似乎低于其它两种。（图1）
随后，利用LNP分别包封circRNA候选药物，然后分别肌肉注射到C57BL/6小鼠体内，结果显示EDIII-Fc circRNA比EDIII-Fd和EDIII circRNA引发更高的IgG和nAb滴度，而且EDIII-Fc比EDIII-Fd和EDIII circRNA更能诱导Th1偏向性T细胞反应。综上，与单体和三聚体EDIII相比，二聚体EDIII-Fc circRNA在小鼠中诱导了更好的生发中心反应和更高水平的中和抗体。（图1）
图1 编码EDIII、EDIII-Fc或EDIII-Fd的circRNA疫苗的免疫原性
二、EDIII-Fc circRNA提供部分保护免受ZIKV感染
在母体被动免疫对新生小鼠的保护作用的评估中，与EDIII-Fd circRNA相比，通过母体免疫EDIII-Fc circRNA可更好地保护后代免受ZIKV攻击。而在circRNA疫苗对成年Ifnar−/− C57BL/6小鼠模型的主动免疫评估中，EDIII-Fc circRNA的降低血清、脑和脾脏中的病毒载量方面比EDIII-Fd circRNA更有效。两种模型中，EDIII-Fc circRNA都提供比EDIII-Fd circRNA更好的保护，但单独使用两者都不足以提供完全的保护。（图2）
图2 EDIII-Fc和EDIII-Fd circRNA的保护作用。
三、联合EDIII-Fc和NS1的circRNA可提高保护作用
为提高疫苗保护作用，研究合成NS1 circRNA，并将等量EDIII-Fc和NS1的circRNA组合成两种不同的配方：EN（LNP）是LNP分别包封两种circRNA；EN（RNA）是LNP包封EDIII-Fc和NS1 circRNA的预混合物。将circRNA疫苗分别肌肉注射到C57BL/6小鼠体内，结果发现两种配方的EDIII-Fc和NS1 circRNA的组合疫苗，与单独circRNA相比，都可更好地保护新生儿免受寨卡病毒引起的症状和脑损伤。（图3）
图3 EDIII-Fc和NS1 circRNA联合单剂量免疫在ZIKV感染新生小鼠模型中的免疫原性和保护作用。
对小鼠进行加强剂量后，EN（LNP）和EN（RNA）有效地抑制了ZIKV引起的脑膜炎症和皮质层状坏死；而EDIII-Fc或NS1 circRNA可大大减少，但不能消除ZIKV引起的脑损伤（图4h）。EDIII-Fc和NS1 circRNA的组合，特别是EN（LNP）配方，有可能提供充分的保护，但需要双剂量。（图4）
图4 EDIII-Fc和NS1 circRNA联合双剂量免疫对ZIKV感染新生小鼠模型的免疫原性和保护作用。
四、circRNA免疫不会增强小鼠的DENV2感染
研究建立小鼠适应的DENV2变体，可增强小鼠毒性。研究circRNA疫苗候选物的ADE效应的评估中发现，EDIII-Fc单独或与NS1联合可引起最小且短暂的DENV反应性抗体，EDIII-Fc单独或与NS1联合，只能引起极少的ADE易感性抗体。这表明，在测试环境中，EN（LNP）免疫不太可能导致小鼠DENV2感染的ADE。（图5）
图5 circRNA原型疫苗在小鼠中的ADE风险。
五、单剂量优化的circRNA疫苗可提供有效的保护
为了提高circRNA疫苗的翻译效率，研究对circRNA进行了优化：使用更高翻译效率的IRES(iHRV-B3），并在上游5’处引入了一个人poly（A）结合蛋白（PABP）的RNA结合基序，在iHRV-B3的IV结构域的近端环处插入了一个eIF4G招募适体（Apt-eIF4G），并在终止密码子的下游3’处添加人α-球蛋白1 (HBA1) mRNA的3 ‘ UTR（图6a）。这些优化显著提高了蛋白质产量，及circRNA作为疫苗的免疫原性。单剂优化EN（LNP）的母体免疫即可完全保护子代免受寨卡病毒感染，也能有效地保护成年小鼠免受寨卡病毒感染。（图6）
图6 优化后的EN（LNP）对小鼠的免疫原性和保护效果。
六、优化后的circRNA疫苗引发持久的保护性免疫
相比原型EN（LNP），优化EN（LNP）显著改善了对通过母体被动免疫的幼鼠的保护性，可预防寨卡病毒引起的生长迟缓、死亡率、神经学症状和脑发育迟顿。而且，优化后的EN（LNP）在小鼠中引发了至少持续11周的保护性免疫。（图7）
图7 优化后的EN（LNP）在小鼠体内引发保护性免疫的持久性。
七、circRNA优化不会增加小鼠DENV2 ADE的风险
研究进一步评估优化circRNA引起的ADE风险，结果表明，在测试条件下，优化后的EN（LNP）疫苗或免疫血清不太可能引起DENV2的ADE而促进小鼠的DENV2感染。（图8）
图8 优化后的EN（LNP）在小鼠中的ADE风险。
结论
综上，基于EDIII-Fc和NS1的circRNA疫苗策略能够有效地保护小鼠免受ZIKV感染，并且不会引起DENV的ADE效应。这项研究不仅提供了一种新的疫苗设计策略，还提供疫苗策略的安全性和有效性的一系列验证方案，并且强调了在疫苗开发中需考虑ADE效应，这对于避免疫苗接种后可能引起的疾病加重风险至关重要。
这项研究证明了circRNA作为疫苗平台的潜力，基于EDIII-Fc和NS1 circRNA的疫苗平台为开发安全有效的黄病毒疫苗提供了新的途径，对于控制ZIKV和DENV等黄病毒的传播具有重要意义。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41467-024-53242-0