环形RNA (circRNA) 是真核生物转录与转录后加工的自然产物，主要由反向剪接 (backsplicing) 产生，其在各种生理条件和人类疾病中行使着重要的调控功能。尽管已有多种顺式元件和反式因子被报道调控环形RNA的生成，但这些调控元件大多位于或结合环形RNA的侧翼内含子区域发挥作用。
2024年10月25日，中国科学技术大学生命科学与医学部王小林副研究员和单革教授团队在Molecular Cell上在线发表题为ZC3H14 facilitates backsplicing by binding to exon-intron boundary and 3′ UTR的研究论文，揭示了ZC3H14蛋白促进反向剪接的新机制，建立了ZC3H14和环形RNA的生物发生与雄性生育的紧密联系。
Orna管线
研究团队基于无内含子基因来源的环形RNA构建了circGFP报告系统，进行全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选，鉴定出ZC3H14蛋白作为环形RNA生成的正调控因子。通过高通量测序分析，作者发现ZC3H14促进约40%环形RNA的生成，但对mRNA的表达与可变剪切没有显著影响。此外，ZC3H14在真核生物中高度保守，其酵母同源蛋白Nab2的敲除同样抑制裂殖酵母中环形RNA的产生。
通过免疫共沉淀和质谱分析，研究团队发现ZC3H14蛋白结合多种剪切体组分。进一步的双分子荧光互补及荧光免疫共沉淀实验表明ZC3H14蛋白可以二聚化甚至寡聚化。ZC3H14 iCLIP-seq分析表明ZC3H14蛋白结合成环外显子两侧的外显子-内含子边界 (Exon-intron boundary, EIB) 及同源基因3′ UTR。ZC3H14结合EIB的突变或3′ UTR缺失均导致环形RNA的表达降低，ZC3H14与3′ UTR的结合能够增强ZC3H14与EIB的结合。单独或联合利用ZC3H14结合的EIB或3′ UTR作为顺式元件能够用于环形RNA表达载体的构建，实现环形RNA不同程度的过表达。
作者发现ZC3H14蛋白在人类与小鼠睾丸组织中高度表达。ZC3H14的敲除导致雄性小鼠后代减少、睾丸减小、精子数目减少且异常精子比例升高，同时睾丸组织中环形RNA的表达显著降低。ZC3H14主要表达在粗线期、双线期精母细胞与圆形精细胞。ZC3H14敲除导致减数分裂进程异常，造成粗线期及双线期联会复合物侧轴断裂，同时伴随粗线期精母细胞环形RNA表达水平降低。在小鼠生殖细胞中，ZC3H14同样结合成环序列两侧的EIB与3′ UTR。此外，通过对公共数据进行分析，作者发现ZC3H14及环形RNA与人类非梗阻性无精症显著相关。
综上所述，该研究鉴定了一个真核生物中保守的反向剪接调控因子ZC3H14，通过结合成环序列外显子-内含子边界和3′ UTR促进环形RNA产生，并揭示了ZC3H14在雄性不育中的生理功能。
中国科学技术大学李奇奇博士和博士生杨刚为文章共同第一作者，王小林副研究员、单革教授为本文共同通讯作者，该工作得到了中国科学技术大学史庆华教授的帮助。
原文链接
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.10.001