Prashant Mali研究团队建立了体外和细胞内合成环状RNA的两种优化策略；还开发了一种蛋白质工程方法，筛选的去免疫Cas9变体利用环状RNA递送，可靶向基因组作用，且降低了免疫原性；优化策略合成的环状RNA，可用于广泛的细胞工程和基因组工程应用。
基因组编辑有望从根源上治疗遗传疾病。然而，有效和安全地实现该治疗策略尤其困难：
① 病毒衣壳作为基因载体的免疫原性较高；
② 高剂量治疗可能引起肝毒性；
③ 脱靶突变具有潜在遗传毒性；
④ DNA质粒的较大且复杂，阻碍体内的递送效率。
传递信使RNA （mRNA）原则上比使用DNA质粒更安全，因为mRNA只是短暂表达。但mRNA表达的持续时间、稳定性和免疫原性也会影响治疗的有效性和安全性。将线性RNA的两端连接成环状形式可增加RNA的稳定性并降低免疫原性。因此环状RNA已被广泛应用：例如，作为抗炎症的适配体，产生蛋白质，作为对抗SARS-CoV-29的疫苗和蛋白质替代应用。
基于I型内含子自剪接系统的排列内含子-外显子（PIE）策略，经常被用于环状RNA体外合成，但有时环状RNA中残余的外来序列（用于促进酶非依赖性环化）可能导致免疫原性。
II型内含子自剪接系统也被用于产生无痕的环状RNA。Mali研究团队利用来自破伤风梭菌的自剪接II组内含子（图1a）和PIE策略在体外合成环状RNA，并结合侧翼Twister核酶高效制备环状RNA。在体外转录过程中，Twister核酶的自裂解去除了免疫原性的5 ‘磷酸，并促进了靠近两端的互补茎的形成。然后，发生自催化II族内含子剪接，释放内含子并连接剪接的末端（图1a）。由此产生的环状RNA，作者将其称为“体外形成的环状RNA”（ocRNA），含由互补茎产生的26个核苷酸剪接痕。体外制备ocRNA的产率在40-75%之间。
此外，在“tornado”系统（持久过表达的twister优化RNA）的基础上，Mali研究团队首先在体外转录线性RNA前体，与ocRNA的相似，但缺乏II型内含子。这线性RNA前体通过twister核酶进行自切割，形成互补的连接茎，但不能自剪接，从而形成“体内形成的环状RNA”（icRNA）的前体形态（图1b）。icRNA前体进入细胞后，通过RtcB连接酶通过羟基和近端5’和3’端的2’,3’-环磷酸进行环化，在细胞中产生环状RNA。icRNA约有20%的环化率。
图1 促进基因组编辑和细胞工程的两种RNA环化策略。
为优化使用ocRNA和icRNA的蛋白质翻译，Mali及其合作者筛选了一组IRES和3 ‘ UTR序列。他们使用脑心肌炎病毒（EMCV） IRES，土旱獭肝炎病毒转录后调控元件和165碱基对poly(A)序列来改善蛋白质翻译。作者随后表明，相比线性和m1Ψ-修饰的mRNA，优化后的icRNA或ocRNA在RNA稳定性、翻译效率、表达蛋白质持久性和诱导细胞活力方面的表现明显更优。例如，icRNA编码的NEUROD1蛋白的持续表达将人类多能干细胞分化为神经元。这些观察结果证实了环状RNA稳定性和蛋白质持久性，强调了基于环状RNA的治疗方法的前景。
Mali研究团队将icRNA和ocRNA应用于基因组工程。他们首先研究了icRNA编码锌指核酸酶介导基因组编辑的实用性。然后，利用编码锌指核酸酶融合转录抑制结构域KRAB的icRNA介导PCSK9（一种编码调节低密度脂蛋白受体降解的酶的基因）的瞬时抑制。通过筛选一组由icRNA递送到PCSK9转录起始位点0 – 1200个碱基对的锌指型KRAB蛋白，67个蛋白中有16个实现了强大的基因抑制（50-90%）。
此外，作者评估了icRNA编码的野生型SpCas9和CRISPRoff（一种可编程表观遗传记忆写入器）在基因组编辑和表观基因组靶向方面的能力。icRNA递送的野生型SpCas9或SpCas9v4蛋白靶向AAVS1位点，介导基因组编辑效率约为50%。野生型dSpCas9或dSpCas9v4 CRISPRoff的icRNA和ocRNA以及相应的sgRNA强烈抑制了β2微球蛋白。
为了在icRNA递送的CRISPR系统在治疗应用中增强持久性并降低其免疫原性，Mali研究团队开发了一种蛋白质工程系统，用于筛选去免疫的Cas9变体。通过组合文库设计、长读纳米孔测序和靶向次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1的阳性筛选，鉴定功能性Cas9变体，研究人员获得了在多个免疫原性表位，并将其突变得到高基因组靶向功能的Cas9变体。
Mali研究团队发展并优化持久性环状RNA的合成策略，用于细胞工程和基因编辑。该研究引发我们一些思考：
① 基于II型内含子自剪接系统的ocRNA（图1a）与源自I型内含子的PIE策略相比的优势值得研究。
② icRNA的低环化效率（约20%）可能引入体外转录icRNA的非环化前体，从而引发细胞免疫反应。
③ 体外转录的icRNA的线性前体在RtcB连接之前是否也在细胞中翻译成蛋白质（图1b），这值得进一步研究。
④ 因为icRNA形成约47 nt的环化茎，这种外来的“疤痕”可能引起细胞免疫反应。
⑤ 可以进一步表征EMCV IRES和其他IRES在神经元和心肌细胞中的细胞特异性。
总之，扩展的ocRNA和icRNA策略用于表达蛋白，将有利于基因组和表观基因组编辑以及细胞工程的一系列应用。此外，增强去免疫Cas9核酸酶的生成有望降低环状RNA的毒性风险。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41551-024-01262-y