J Extracell Vesicles丨膀胱癌胞外囊泡递送circRNA-LIPAR，促进淋巴结转移前生态位形成

膀胱癌（BCa）优先通过淋巴系统从原发部位扩散到引流淋巴结（LN）。引流LN可能不是转移细胞的被动受体，而是在转移扩散发生之前就被原发肿瘤选择性和主动地修饰。然而，BCa引流淋巴结中淋巴重塑转移前生态位形成的分子调控机制仍未明。

细胞外囊泡（EV）是大多数细胞分泌的具有脂质双分子层的纳米囊泡。含有促转移因子的肿瘤源性EV可通过循环远离其原发部位，促进转移前生态位的形成并增加肿瘤的转移。肿瘤来源的EV可通过其表面的分子“停靠”到其他组织上，然后与组织融合并释放其促转移的内容物。EV释放的促转移内含物可重塑受体细胞的基因表达和代谢模式，触发功能重编程和形态重塑，加强转移前生态位的形成。

研究对膀胱癌(BCa)组织源性EV进行了高分辨率蛋白质组学分析，结合纳米流式细胞术，发现了一个含有整合素α6 (ITGA6⁺ EV)的新肿瘤源性EV亚群。BCa来源的ITGA6⁺ EV通过靶向淋巴内皮细胞递送circRNA-LIPAR，诱导SELE标志性的淋巴重塑转移前生态位。

机制上，LIPAR将ITGA6连接到RAB5A的开关II结构域，并维持RAB5A GTP结合的激活状态，从而通过内体运输产生装载LIPAR的ITGA6⁺ EV。ITGA6⁺ EV通过ITGA6-CD151相互作用靶向淋巴管，释放LIPAR诱导SELE过表达的淋巴重塑转移前生态位。

研究利用工程ITGA6 EV递送SELE抑制剂，用于抑制淋巴转移前生态位，从而抑制淋巴转移并延长临床前模型的生存期。

总之，该研究揭示了BCa衍生的ITGA6⁺ EV介导转移前生态位的机制，并提供了一种基于工程EV的对抗BCa淋巴转移策略。

让小编感兴趣的是，研究利用PIE法体外合成环状RNA LIPAR，并通过体外方式封装到工程EV中，产生富含环状RNA LIPAR的工程EV，用于验证ITGA6⁺ EV中LIPAR的功能和作用机制。这为外泌体中circRNA的功能和机制研究以及circRNA的递送和应用提供了新思路。

一、BCa来源的EV诱导引流LN形成转移前生态位

研究分离出BCa细胞来源的EV（UM-UC-3-EV）和正常膀胱上皮细胞来源的EV（SV-HUC -1-EV）进行小鼠体内实验，证实BCa源性EV在引流淋巴结中诱导转移前生态位形成，促进BCa淋巴转移。

BCa源性EV作用LN的下一代测序（NGS）结果表明，BCa来源EV作用的LN转移前呈现淋巴管SELE过表达的生态位特征。研究还揭示了BCa衍生的EV通过促进BCa细胞在引流LN中的粘附和定植，以E-selectin（SELE）依赖的方式诱导淋巴重塑相关的转移前生态位，从而促进淋巴转移。（图1a-f）

二、促进独特生态位形成的BCa衍生EV表面有ITGA6

利用4D label-free定量蛋白组以及免疫电镜技术，研究发现位于膜双分子层外的ITGA6蛋白在BCa组织和细胞来源EV中显著高表达，BCa来源的ITGA6⁺ EV可在淋巴管中诱导SELE过表达，介导引流LNs转移前生态位形成。（图1g-h；图2a-g）

研究通过免疫共沉淀（Co-IP）、Western Blot、邻近连接技术（PLA）、多模态结构照明超分辨显微镜(Multi-SIM)等技术，证明了ITGA6在BCa衍生EV中与ITGB4形成二聚体。

图1 BCa衍生的ITGA6⁺ EV与引流LN的转移前生态位相关

三、BCa衍生的ITGA6⁺ EV靶向HLEC上调引流LN中SELE的表达

从UM-UC-3细胞中提取DiD染料标记的EV，检测其进入腘动脉LN内不同细胞群的情况，结果发现BCa衍生的ITGA⁺ EV以ITGA6依赖的方式特异性靶向HLEC细胞。（图2h-m）

此外，研究利用ITGA6-Lamp2b质粒成功构建表面修饰ITGA6的工程EV，利用工程EV证明了BCa衍生的ITGA6⁺ EV诱导SELE过表达，通过靶向引流LNs中的HLEC，促进肿瘤细胞粘附。（图3a-q）

图2 BCa衍生的ITGA6⁺ EV在引流LN中靶向HLEC。

图3 BCa来源的ITGA6⁺ EV上调SELE表达，促进BCa细胞粘附。

四、 BCa衍生的ITGA6⁺ EV通过与CD151相互作用靶向HLECs

EV的高效靶向性由EV上的膜蛋白和受体细胞膜受体的特异性结合决定的，研究也利用免疫荧光、His pull-down、Co-IP等技术证明了BCa衍生的EV通过其膜上的ITGA6与CD151相互作用靶向HLEC。（图4a-i）

五、circRNA LIPAR在BCa衍生的ITGA6⁺ EV中富集

EV通过传递不同的生物分子，在受体细胞中更好地实现生物效应，其中在肿瘤源性EV中具有高稳定性和丰度的circRNA被广泛研究。研究对分离的ITGA6⁺ EV进行了circRNA-seq和相关的验证，发现在BCa衍生的ITGA6⁺ EV中hsa_circ_0045334显著过表达；hsa_circ_0045334的富集与引流LN中淋巴重塑相关转移前生态位呈正相关。因此，研究团队将hsa_circ_0045334命名为淋巴转移相关的转移前生态位相关circRNA（LIPAR）。（图4j-n）

图4 ITGA6⁺ EV通过与CD151相互作用靶向HLECs转移circRNA LIPAR。

六、在BCa细胞中，LIPAR与RAB5A和ITGA6形成三元配合物

为探索LIPAR在BCa细胞中的被封装的机制，通过RNA pull-down结合质谱和Western Blot、RIP、Co-IP、PLA、LIPAR过表达和干扰等一系列验证，研究揭示了在BCa细胞中，RAB5A蛋白可与ITGA6和LIPAR相互作用。LIPAR作为支架连接RAB5A-ITGA6形成三元配合物的支架。（图5a-o）

七、三元复合物LIPAR/RAB5A/ITGA6激活RAB5A，将LIPAR包装成ITGA6⁺ EV

进一步分析LIPAR/RAB5A/ITGA6三元配合物结构，发现LIPAR在RAB5A上的预测结合区域位于开关II结构域，该结构域与蛋白质“GDP解离抑制剂”（GDI）相互作用，使RAB5A保持在非活性的GDP结合状态。LIPAR介导形成的LIPAR/ITGA6/RAB5A三元复合物可诱导RAB5A持续激活，通过内体运输过程促进LIPAR和ITGA6包装成BCa来源的EV。（图5p-v）

图5 LIPAR/ITGA6/RAB5A三元复合物介导LIPAR封装成ITGA6⁺ EV。

八、ITGA6⁺ EV将LIPAR传递到HLEC中以增强SELE转录

然后，研究探索了BCa衍生的ITGA6⁺ EV的LIPAR是否被递送到HLEC中。与LIPAR过表达的BCa来源的EV孵育后，HLEC中LIPAR的表达显著上调；而BCa细胞中LIPAR表达下调的EV则削弱了HLEC中LIPAR表达的能力。ITGA6中和抗体或敲低CD151处理HLEC的验证结果显示，LIPAR通过与ITGA6和CD151互作，被封装进ITGA6⁺ EV，从而精确地转移到HLEC中。（图6a-k）

研究表明，BCa衍生的ITGA6⁺ EV中LIPAR，介导了引流LNs中淋巴重塑相关转移前生态位的作用。LIPAR是通过怎样的机制起作用的呢？通过荧光素酶报告检测、ChIRP、ChIP等技术，研究进一步揭示了在HLEC中，BCa衍生的ITGA6⁺ EV中LIPAR招募转录因子p300（组蛋白乙酰转移酶），增加组蛋白3上Lys9的乙酰化水平（H3K9ac），从而激活SELE转录。（图6l-s）

图6 ITGA6+ EV将LIPAR传递到HLEC中以增强SELE转录。

九、ITGA6⁺ EV包装的LIPAR诱导LN转移前生态位形成，促进小鼠BCa的转移

研究利用PIE法体外合成circRNA LIPAR，并成功将其包装进工程EV中（工程EV LIPAR），用于小鼠模型，结果表明工程EV LIPAR可成功地将LIPAR递送到引流LN，显著上调LN淋巴血管中SELE的表达，并显著诱导引流淋巴结转移前生态位，促进BCa淋巴转移。在原位BCa转移异种移植小鼠模型血管内注射的EV LIPAR显著增强BCa的盆腔淋巴结转移；而足垫注射可显著促进BCa的腘窝淋巴结转移。综上，EV LIPAR可上调SELE表达，从而创建淋巴重塑相关的转移前生态位，并促进BCa淋巴转移。（图7a-n；图8a-h）

图7 ITGA6⁺ EV包装的LIPAR诱导转移前生态位促进LN转移。

图8 LIPAR触发BCa衍生的EV诱导淋巴结转移的转移前生态位。

十、 在临床前模型中，通过工程EV靶向阻断SELE抑制转移前生态位并抑制LN转移

为了实现在引流LN中的靶向阻断SELE，研究将装载SELE选择性抑制剂的工程EV（工程EVSELE-inhibitor）注射到模型小鼠体内，以降低淋巴管中SELE的表达，结果表明，在临床前模型中，EVSELE-inhibitor可抑制转移前生态位的形成，并抑制BCa的淋巴转移。

十一、BCa中ITGA6⁺ EV包装的LIPAR临床相关性的多中心分析

研究还检测了ITGA6⁺ EV内LIPAR在BCa中的临床相关性。结果发现，在临床样本中，ITGA6/LIPAR/SELE轴广泛参与BCa转移前生态位的形成和淋巴转移。

研究团队在膀胱癌组织中发现ITGA6⁺ EV，与引流LN 形成转移前生态位和淋巴转移呈正相关。研究还揭示了ITGA6⁺ EV通过向淋巴内皮细胞递送circRNA-LIPAR介导转移前生态位的机制，并开发利用工程ITGA6⁺ EV抑制淋巴转移前生态位，抑制BCa淋巴转移策略。

https://isevjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.12518