mRNA疫苗是抗击传染病的新兴技术，最近稳定性更高的环状RNA （circRNA）疫苗亦受关注。然而，疫苗开发仍面临许多挑战，包括免疫反应的有效性、持久性和广泛性。因此需要开发更广谱的疫苗以诱导针对多种病毒变体的交叉反应性抗体响应。
将抗原和免疫刺激佐剂结合成一个配方，有利于这两个关键成分同时递送到相同的抗原呈递细胞。将佐剂和抗原整合在相同的circRNA中，可简化生产过程，降低成本优势，有利于制定临床可翻译的疫苗。利用这种策略可更简单、更有效地开发递送材料和佐剂分子。
趋化因子（C-X-C基序）配体（CXCL13）可通过与其受体CXCR5相互作用，促进生发中心（GC）的形成，从而协调体液免疫，对B淋巴细胞和Tfh细胞具有趋化作用，可增强免疫应答的强度。CXCL13在诱导广泛中和抗体（bnAbs）产生中的潜在作用。
RNA疫苗在功效方面取得的显著进展，然而其稳定性和保存方面的研究相对滞后。冻干有利于LNP-RNA疫苗室温下的长期保存，但在冻干和再水化过程中引入的机械应力可能导致脂质膜损伤，导致mRNA泄漏。mRNA-LNP疫苗的靶向修饰可其增强免疫应答方面的作用，而冻干技术是否会破坏LNP的靶向修饰，影响疫苗的效力仍有待研究。
近日，华中农业大学赵凌教授团队在PNAS期刊上发表研究论文：CXCL13 promotes broad immune responses induced by circular RNA vaccines。
研究开发一种靶向淋巴结（LNs）的脂质纳米颗粒（LNP）包封的整合编码抗原和CXCL13的circRNA的疫苗。通过CXCL13和抗原的共递送，CXCL13增强了针对流感病毒和SARS-CoV-2的交叉反应抗体，在小鼠模型中实现了对同源和异源流感病毒攻击的保护。用抗体靶向修饰LNP表面有助于提高LNP-circRNA冻干疫苗的稳定性。总之，研究开发的基于circRNA的抗原-CXCL13共表达系统提供了一个简单而强大的平台，增强了针对多种病毒糖蛋白的抗体反应的强度和广度，突出了CXCL13在诱导广泛免疫反应方面的潜在效用，展现了circRNA作为疫苗载体的稳定性、兼容性和有效性等优势。
结果
编码CXCL13和HA的circRNA靶向递送到LNs可增强免疫应答
研究将佐剂CXCL13和病毒抗原HA整合在同一个circRNA中共表达，并利用LNP封装。DEC-205主要在树突状细胞上表达，anti-DEC-205抗体有利于抗原在体内靶向递送到树突状细胞。为了促进CXCL13在引流LN （dLN）内的作用，研究利用马来酰亚胺/硫醇将anti-DEC-205抗体共轭修饰到LNP（称为tLNP）。在细胞和免疫小鼠实验验证了HA- CXCL13 circRNA tLNP制剂可有效将HA和CXCL13成分递送到相同的抗原呈递细胞；且与非靶向疫苗相比，可诱导显著更高的抗体水平。（图1）
图1 靶向LNs的HA-CXCL13-circRNA tLNP疫苗的设计与表征。
CXCL13诱导LN转录组重编程
研究通过检测免疫接种小鼠dLn转录组的变化，发现接种HA-CXCL13-circRNA tLNPs后小鼠dLn转录组发生了实质性变化：适应性免疫、趋化因子活性、细胞因子活性、NOD样受体信号和炎症反应相关通路广泛富集；IL-21和IL-4等基因的表达显著增加。（图2）
图2 转录组分析显示，CXCL13表达小鼠和对照小鼠之间存在明显的免疫应答。
CXCL13诱导强大和高水平的生发中心反应
研究通过持续检测接种HA-circRNA tLNPs和HA-CXCL13-circRNA tLNPs免疫小鼠的GC动态，证明了CXCL13能有效促进GC反应，并在一定程度上延长GC反应。（图3）
CXCL13促进CD4+和CD8+ T细胞反应
相比HA-circRNA，HA-CXCL13-circRNA可诱导更多的CD4+ TEM，增强了TNF-α+、IL-2+和TNF-α+ IL-2+ CD4+ T细胞向脾脏的募集，并引发了有效的CD8+ T细胞反应。（图3）
图3 HA-CXCL13-circRNA增强了体液和细胞免疫反应。
CXCL13增强交叉反应性和颈部特异性抗体反应
与HA-circRNA相比，HA-CXCL13-circRNA可促进dLN发育，且在免疫后第10天诱导了更多的GC。用流感病毒H1N1 PR8株或H3N2 V11株HA序列构建的circRNA疫苗接种到小鼠中，发现HA-CXCL13-circRNA可诱导更高水平的同亚型甚至跨亚型HA抗体；还可促进保守但亚显性的茎区抗体的产生，而在HA-circRNA组中未发现。研究还利用血凝抑制（HAI）试验，证明了HA-CXCL13-circRNA可增强特异性功能抗体应答，还可诱导交叉反应性抗体应答。（图4）
图4 CXCL1-circRNA佐剂HA-circRNA免疫可引起交叉反应性抗体应答。
增强对同源和异源流感感染的保护作用
研究发现，单剂量HA-CXCL13-circRNA对同源流感病毒感染有完全保护作用，对异源流感病毒感染具有90%的保护作用，但与双剂量方案相比，单剂量在面对异源流感病毒感染时仍然存在低风险。（图5）
在狂犬病毒模型中，编码狂犬病毒糖蛋白(G)的G- circRNA和G-CXCL13-circRNA均诱导了对狂犬病毒的完全保护，但CXCL13显著增强了抗体水平，这有利于进一步减少疫苗剂量，同时保持对狂犬病毒的完全保护。
研究还提供了HA-CXCL13-circRNA tLNPs疫苗在小鼠中的安全性的初步数据：与PBS组小鼠相比，HA-CXCL13-circRNA tLNPs疫苗免疫小鼠的主要器官未见明显的组织病理学变化，肝脏和肾脏功能标志物在刺激后第1天和第7天的某些时间点超过正常范围，但随后恢复到正常水平；血液学参数无显著差异。
图5 CXCL13增强对同源和异源流感病毒攻击的保护作用。
CXCL13增强了针对SARS-CoV-2变体的抗体反应的强度和广度
研究构建的编码SARS-CoV-2三聚体RBD的RBD-CXCL13-circRNA疫苗，可有效增强针对多种SARS-CoV-2变体的抗体应答的强度和广度。（图6）
研究还对编码SARS-CoV-2刺突(S)蛋白的S-CXCL13-circRNA-tLNP和类似Moderna mRNA-1273的S-mRNA-LNP疫苗的效果进行了对比，两种疫苗在加强免疫后均能诱导较高的抗体滴度，但S-CXCL13-circRNA-tLNP疫苗诱导的IgG和NT50明显高于S-mRNA-LNP。而且，接受两剂S-CXCL13-circRNA-tLNP疫苗的小鼠不仅产生针对武汉-Hu-1菌株的血清中和抗体，还产生针对其他变体的中和抗体，且诱导的抗体滴度也显著高于S-mRNA-LNP疫苗。
图6 RBD-CXCL 13-circRNA疫苗可诱导针对多种病毒变体的交叉反应性抗体。
CXCL13具有强佐剂活性，可增强蛋白亚单位疫苗的效力
研究将PR8 （H1N1）流感病毒HA重组蛋白（rHA）与CXCL13-circRNA混合，验证了CXCL13-circRNA对蛋白亚单位疫苗也有增强作用，CXCL13-circRNA具有固有的佐剂特性，可有效增强抗体对病毒变体的反应强度和广度，可能是蛋白质亚单位疫苗平台的潜在独立佐剂。
抗体修饰增强LNP的冻干和靶向稳定性
HA-CXCL13-circRNA tLNPs疫苗在4°C保存14 d，主要特征指标无明显变化；在25°C ，基本物理性质和抗体滴度在至少保持7天；在37°C ，抗体滴度在第7天显著下降。这表明，HA-CXCL13-circRNA tLNPs疫苗制备后具有良好的短期热稳定性。
研究团队发现用anti-DEC-205抗体修饰的LNP与常规LNP相比，在冻干过程中具有显著的稳定性。即使添加了足量蔗糖（8%蔗糖），在冻干过程中LNP物理和化学性质仍然受到一定程度的损害，可能间接导致疫苗免疫原性降低；而tLNP的物理化学性质或免疫原性与新鲜制备的疫苗没有显著差异，靶向特异性保持稳定。当蔗糖含量降至2%，tLNPs在LN内的抗原分布开始略有减少，诱导的抗体水平无显著差异。
研究表明，tLNP具有良好的冻干稳定性和靶向稳定性，在少量冷冻保护剂的存在下可保持至少7个月的稳定性，为疫苗的临床转化提供了一定程度的保证。
总结
研究将抗原和佐剂直接整合到circRNA中，并将其装载在靶向性的LNP中，从而增强疫苗接种诱导的抗体反应的广度和强度的一种策略。CXCL13可显著增强针对流感和SARS-CoV-2病毒的抗体应答的广度和强度。此外，CXCL13可有效增强单剂量流感circRNA疫苗对异源流感病毒的保护作用，增强单剂量狂犬病circRNA疫苗的免疫原性，这凸显了CXCL13促进单剂量疫苗开发的潜力。HA-CXCL13-circRNA tLNPs疫苗不需要补充外源性物质进行免疫刺激，在临床应用中具有潜在的安全性优势。
原文链接
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2406434121