环状RNA（circRNA）相比线性mRNA具有更高的细胞稳定性，且适当纯化的circRNA即使不进行碱基修饰也具有较低的免疫原性。因此，circRNA有望作为一种新型mRNA疫苗，为下一代RNA治疗提供更广泛的策略。
circRNA的翻译主要由内部核糖体进入位点（IRES）或IRES样元件驱动。IRES元件介导的翻译受各种IRES反式作用因子（ITAF）的RNA结合蛋白（RBP）调节。当机体处于遗传毒性应激、缺氧、ER应激、营养剥夺、体温过低、体温过高或感染等状态下，线性mRNA的帽依赖性翻译起始可能被抑制，导致无法有效翻译，因而降低了疗效。而circRNA可凭借非帽依赖性翻译机制的优势，使蛋白质的正常翻译，保证药物疗效。
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普遍IRES介导的翻译水平有限。此外，IRES活性高度依赖于特定ITAF的表达和活性，这可在特定细胞类型中调节IRES介导翻译。因此，识别这些ITAF类型及调控机制，对提高circRNA翻译效率和特异性至关重要，有利于开发基于circRNA的新型翻译工具和应用疗法。
2024年11月8日，中科院上海生命科学研究院王泽峰团队在预印本bioRvix上发表论文：Systematic screen of RNA binding proteins that enhance circular RNA translation。
研究阐述团队开发一个基于细胞的系统，用于筛选增强circRNA翻译的RBP，并鉴定出68种作为非经典翻译激活因子的蛋白。此外，研究还开发了一种机器学习算法，用于提取这些激活因子的共同序列特征，从而预测更多具有翻译激活子活性的潜在RBP，经证实这些激活因子可促进IRES介导的circRNA翻译。该研究为发现IRES反式作用因子的功能和开发工程circRNA药物平台提供了新的见解。
翻译激活因子功能
研究开发了报告系统识别促进circRNA翻译的反式作用因子。经过系统筛选，发现了一系列可将circRNA的相对翻译效率（TE）提高至少30%的RBP，并在110个RBP中鉴定出68个翻译激活因子（图1E）。利用GO分析，揭示候选激活剂的潜在生物学功能，这些翻译激活因子与翻译起始（真核起始因子eIFs和核糖体蛋白）、RNA加工（hnRNP）和核糖体生物发生（DDX家族）有关（图1F）。
研究团队之前发表的文章中鉴定了翻译激活因子hnRNPUL1、RPS2、IGF2BP3和SRSF1可结合短IRES样元件驱动环状RNA翻译[1]。该研究还从DEAD-box解旋酶家族中鉴定出超过10个翻译激活因子（图1F），其中一些成员也已被证明具有ITAF活性。
由双顺反子报告系统测量的RBP翻译增强活性与在circRNA环境下的活性高度相关，这表明某些RBP在促进帽独立翻译中可能具有普遍作用。
图1 筛选促进circRNA翻译的RBP。
翻译激活因子分布
研究根据Uniprot数据库亚细胞定位对翻译激活因子进行的聚类分析，结果发现鉴定出的大部分翻译激活因子位于细胞核和细胞质，与之前的研究一致：大多数已知的ITAF穿梭于细胞质和细胞核之间，调节IRES介导的翻译。68个翻译激活剂中，27个与包含许多特定翻译起始因子的应激颗粒有关，而12个与介导mRNA降解和衰变的P小体有关。这种分布模式表明这些RBP可能在细胞应激下发挥类似ITAF的作用，调节circRNA翻译。
翻译激活因子的内源性作用
团队进一步将68种新发现的翻译激活因子与55个已报道的ITAF进行比较。结果显示，有14种新发现的翻译激活因子曾被报道为ITAF（eIF4A1、eIF4G1、eIF4G2、eIF5B、FUS、hnRNPK、hnRNPM、NCL、PA2G4、PTBP1、RACK1、RPL11、RPL26、RPL38），其余54种为新的翻译激活剂（图2A）。来自La相关蛋白家族（LARP1、LARP4、LARP4B、LARP7）和异质核糖核蛋白（hnRNPA3、hnRNPF、hnRNPH1、hnRNPU、hnRNPUL1）的许多成员表现为促进circRNA翻译的潜在ITAF。
研究利用ENCODE联盟在HepG2和K562细胞获得的增强交联免疫沉淀（eCLIP）数据，进行了翻译激活因子或ITAF的RNA结合模式分析。结果显示，在HepG2细胞中大部分报道的ITAF和激活因子结合5’UTR和3’UTR区域，而DDX3X、eIF3D、EFTUD2和U2AF1除了结合HepG2细胞中的5’UTR ，还会结合CDS区域（图2B）。结合模式在K562细胞系中略有不同，可能由于细胞特异性和eCLIP数据质量变化的影响。
其中DDX3X、LARP4为IRES区域相关性最强的两个RBP（图2C）。DDX3X可作为ITAF发挥作用，促进IRES依赖性翻译，而LA相关蛋白作为ITAF在调节非帽依赖性翻译的潜在作用仍未有研究。
研究在HepG2细胞中对LARP7进行eCLIP分析，并针对泛素相关蛋白2 （UBAP2）、热休克70 kDa蛋白8 （HSPA8）和跨膜蛋白107 （TMEM107）基因的5’UTR内三个不同的结合峰进行后续验证（图2D）。结果发现，LARP7可能通过与其靶RNA结合，发挥ITAF调控circRNA翻译的作用。
图2 激活剂可通过结合内源性RNA的靶点，从而增强circRNA翻译。
翻译激活因子功能域
许多RBP具有模块化配置，具有特异性识别其靶标的RNA结合域和调控RNA代谢的功能域。RBP的特定功能域或非结构片段可模拟完整蛋白质，调控选择性剪接、反向剪接和靶RNA定向翻译。
研究发现，除了典型的结合结构域（FUS、RBM28和LARP7），RBP还可能含有RNA解旋酶结构域（DDX21、eIF4A1和SKIV2L2）。某些激活因子（DDX21、eIF5B、RBM28、SRRM1）的N端或C端片段表现出与全长蛋白相当的活性。而且DDX21-Nterm（包含解旋酶ATP）、eIF5B-Nterm（包含2个IDR）、RBM28-Cterm（包含2个RRM）和SRRM1-Cterm（包含一个IDR）可具有完整蛋白质的几乎所有翻译调控活性（图3B）。
而hnRNPUL1的N端片段只能促进全长蛋白的一半TE活性，hnRNPUL1-Cterm则没有提高TE的活性。此外，NMD3、LARP7、eIF4A1、FUS和PES1等翻译激活因子的N端和C端截断都可增强circRNA翻译。这些截断的活性通常低于全长蛋白，表明这些翻译激活因子中可能不存在抑制结构域。而SKIV2L2和eIF3D的截断都不能如全长蛋白般激活circRNA翻译（图3B）。
然而，这些翻译激活因子的注释结构域并无法可靠地预测其是否具有相应的功能活性。eIF4A1和SKIV2L2都具有RNA解旋酶结构域（ATP结合域和C末端子域）。这两个子结构域都具有与全长eIF4A1相当的翻译促进活性，而含有整个RNA解旋酶结构域的SKIV2L2的N末端截段并不能激活翻译（图3B）。这表明，除注释结构域外，RBP的翻译促进活性可能与其它结构域有关。氨基酸序列比对结果显示，蛋白质的翻译调节功能可能与氨基酸序列密切相关（图3C）。
图3 对所识别的激活子进行结构域分析，发现序列相似性。
促进IRES介导的circRNA翻译
病毒IRES已被广泛用于介导circRNA翻译，作为新一代mRNA治疗平台技术。根据序列特征和二级结构，IRES元件可分为四种类型，其中三类需要额外的蛋白质因子作为ITAF进行调控，通常结构较紧凑的IRES需要较少辅助蛋白质因子。
III型和IV型IRES需要细胞辅助因子的帮助，包括RIF和ITAF，以实现有效的核糖体组装，而II型IRES仅需要一部分EIF和一些ITAF介导翻译。然而，I型IRES能直接招募核糖体进行翻译起始，而无需其它因子帮助。
研究开发了一个机器学习模型，用于预测circRNA的翻译激活因子。此外，团队将4个IRES序列，包括柯萨奇病毒B3（CVB3，IV型）、脑心肌炎病毒（EMCV，III型）、丙肝病毒（HCV，II型）和经典猪瘟病毒（CSFV，II型）插入环状荧光素酶报告基因中，还包含一个用于PUF融合蛋白栓系的上游位点，与PUF-RBP共表达，以验证相关因子在促进circRNA翻译中的活性（图4A）。
研究发现，筛选鉴定的翻译激活因子，如DDX21 、 eIF3D 、 LARP7和预测得到的DEK、eIF3J、PAIP2B，可用于增强IRES介导的circRNA翻译，其活性取决于与不同IRES的组合。
图4 新发现的激活因子可促进IRES介导的circRNA翻译。
总结
优化翻译效率对于利用circRNA作为新一代mRNA药物至关重要。以往的研究主要集中在顺式元件（如IRES，UTR）的设计和改进上，而对调控蛋白作用的研究相对有限，尽管它们在circRNA翻译中起着关键作用。这项研究通过筛选一个RBP文库，系统地研究了可能增强不依赖帽结构的circRNA翻译的RBP。
研究除了扩展了目前对circRNA翻译调控的认识外，还可能为circRNA药物开发新平台技术的应用提供价值。这些特定表达的翻译激活因子可用于调控IRES介导的circRNA在不同细胞环境下的翻译。例如，可利用翻译激活因子在不同细胞类型及其同源结合位点中的表达偏好，设计在某些细胞中“启动”的IRESs，这有利于设计具有T细胞特异性翻译的环状RNA，用于癌症治疗。该研究将为调控circRNA翻译提供一种可行的策略，从而增强其在RNA治疗中的应用。
原文链接
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.11.07.622558v1
参考资料
[1] Fan, X., et al. Pervasive translation of circular RNAs driven by short IRES-like elements. Nat Commun 13, 3751 (2022).
