Nat. Rev. Bioeng丨赵方庆团队综述工程化环状RNA药物功能、制造及应用的进展与挑战

设计合成的circRNA，可用于治疗（通过编码蛋白质）或顺式作用因子等不同的用途（图1）。

图1 工程化circRNA的关键用途。

（1）蛋白质翻译

由于其高稳定性，circRNA非常适合编码免疫原性和治疗性蛋白。设计用于翻译蛋白的工程化circRNA设计翻译元件、ORF和UTR等。

●通过IRES和RNA修饰的非帽依赖性翻译起始

缺乏5’帽结构的circRNA可通过IRES元件，以不依赖帽结构的方式启动翻译。此外，真核RNA中最丰富的内源性修饰N6 -甲基腺苷（m⁶A）也可驱动circRNA的翻译。

●环状ORF的不同设计

独特ORF排列：除标准ORF，circRNA也可从人类非规范起始密码子CUG、GUG和UUG启动翻译。利用circRNA独特的环状结构，可在反向剪接连接位点的排列ORF序列，确保只有环状RNA（非线性形式）才能产生预期的蛋白质。

翻译更长的蛋白质：非3的整数倍的ORF，在经过环化位点后，翻译在不同的阅读框中进行，使circRNA在移码停止密码子终止之前连续两到三次合成蛋白质。在没有终止密码子的情况下，无限circRNA ORF中产生长重复肽，可放大信号。这种设计允许circRNA编码比circRNA长度更大的蛋白质，为强大的蛋白质翻译提供了灵活的策略。

●5’和3 ’ UTR区域的其他调控元件

UTR元件可通过直接碱基配对或建立UTR介导的蛋白质-蛋白质相互作用，影响翻译过程。识别有效的circRNA UTR元件并研究其调控机制，可能为circRNA工程化提供有价值的见解，最终导致更强大和高效的circRNA翻译。

（2）顺式作用（cis-acting）circRNA

●microRNA海绵：工程化circRNA可作为miRNA海绵的应用，circRNA分子海绵具有比对应线性RNA更强的作用。

挑战：circRNA分子海绵及其靶miRNA的难以周转化学计量学难以评估。因此，需要严谨的实验验证和关键参数优化，如miRNA结合位点的数量和类型以及间隔序列的大小。

●蛋白质调控剂：CircRNA可作为蛋白支架或拮抗剂直接与RBP相互作用，从而在转录后水平调控基因表达。

挑战：设计蛋白质调节剂需要严格筛选高度特异性的结合基序，因为相同的基序可被几种蛋白质识别。

●顺式调节因子：CircRNA也可作为顺式调节因子，与互补RNA或DNA直接碱基配对，调节亲本基因的表达。

●转录组和基因组编辑：在基因组和RNA编辑中，工程化circRNA可克服线性引导RNA的低效率和短寿命问题。

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（1）体外合成（图2）

图2 利用连接酶和PIE系统体外合成工程化circRNA。

① 体外转录

利用限制性核酸内切酶酶切DNA模板（含T7启动子），从质粒进行PCR扩增或线性化制备，使用RNA聚合酶在体外转录体系中合成线性RNA前体。DNA模板的纯度和浓度以及反应时间对反应效率也起着至关重要的作用。

② 环化策略

●化学连接法

使用冷凝剂，如溴化氰（BrCN）和1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC）可进行RNA环化。

劣势：会导致2’-5’磷酸二酯的形成，从而降低环化效率，并引起生物安全问题。因此，化学合成方法目前不是RNA环化的主流方法。

●酶连接法

利用T4 DNA连接酶（T4 Dnl）、T4 RNA连接酶1（T4 Rnl 1）和T4 RNA连接酶2（T4 Rnl 2）可通过ATP依赖的方式，催化RNA中的5’磷酸和3’ OH间形成3’-5’磷酸二酯键。连接反应要求RNA底物末端无二级结构。添加约20 nt的夹板序列可防止线性RNA折叠，并使环状化位点更接近，可提高效率。

T4 Dnl识别碱基配对双链的缺口，依赖DNA夹板和线性RNA前体的完全互补；连接DNA/RNA杂交体的效率比双链DNA低1000倍以上，RNA连接效率比T4 Rnl低10到1000倍。因此，这种方法很少用于环状RNA合成。

T4 Rnl 1和T4 Rnl 2都表现出更高的RNA循环效率。虽然连接单链的T4 Rnl不依赖于DNA夹板辅助，但其连接双链底物的效率比T4 Rnl 2低100至1000倍。而当存在内部互补序列或引导RNA时，T4 Rnl 2对双链RNA底物的连接效率更高。

优势：不引入外源核苷酸序列，可最小化免疫原性。

劣势：酶成本较高，对较长或复杂结构RNA的环化效率较低，存在分子间的副反应。

③ 核酶催化环化

●I型内含子自剪接

通过在两个排列的半I型内含子之间插入外源序列，开发了PIE系统。在镁离子存在下，外部鸟苷-5’三磷酸（GTP）依次攻击5 ’和3 ‘内含子的剪接位点，通过两步酯交换反应产生环状外显子。PIE方法的效率、成本效益和方便性优于酶连接。

提高环化效率：基于鱼腥藻的催化内含子，在5′和3′侧分别插入19 nt的同源臂、内部同源臂和间隔物以增强互补性。优化后可使体外合成较长的circRNA。

降低免疫原性：“Clean-PIE”技术采用密码子简并设计双功能密码子组合，编码目标蛋白序列，同时也作为PIE内含子的组成部分。该方法减少了在环化产物中引入额外序列，使环化更简单，环化效率更高，产品纯度更高，免疫原性更低，蛋白质翻译效率更持久。此外，仅四膜虫I型内含子的P1螺旋结构就足以产生circRNA，而无需引入外来片段。

●II型内含子自剪接

II族内含子剪接通过两个酯交换反应发生。在自催化剪接反应中，5’剪接位点首先受到内含子中腺苷残基的2 ’ -OH的攻击。新形成的3’-OH末端残基攻击3 ’剪接位点，产生剪接的外显子-外显子连接和带有2’ -5 ’磷酸二酯键的分支内含子。基于PIE策略，环状编码RNA （CirCode）系统已被开发使用排列的II族内含子进行体外自催化。通过对II族内含子序列的合理设计和定制修饰，CirCode实现了约80%的环化效率，产生了无痕的circRNA，没有多余的序列，并扩展了翻译能力。

●发夹核酶

发夹核酶属于一类自我切割的RNA分子，其特征是高度折叠的发夹或茎环结构。移除3’和5 ’端，形成含有5’羟基和2 ’，3 ‘环磷酸的中间体，随后连接成环状。这种环化反应主要产生50-150 nt的小RNA环，由于催化裂解和连接之间动态平衡，该过程较为不稳定。

优化：设计用于防止自环化的工程发夹，加上额外的RNA激活剂和多胺辅助因子。激活RNA和精胺辅因子的结合诱导核酶的构象变化，激活裂解和环化。当激活剂与环状RNA分离时，最终的环状产物是不可逆而稳定的。

目前的体外策略可达到90%以上的环化效率，以及HPLC纯化后可得到纯度约90%的circRNA。此外，酶连接也可通过使用带有修饰腺嘌呤类似物（2,6-二氨基嘌呤，DAP）的夹板DNA以及筛选或设计具有改进催化活性的RNA连接酶和核酶进行优化。

④ 富集和纯化

体外环化过程中产生的线性RNA可导致强烈的细胞免疫应答。环化产物的富集和纯化对于提高效率和减轻免疫原性至关重要。

●RNase R：可消化线性RNA同时保留环状RNA。然而，RNase R的有效消化需要足够长的单链3 ‘悬臂进行起始，而高度结构化的G-四链体的存在会阻碍RNase R的消化。

●尺寸分离纯化技术：如聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和高效液相色谱（HPLC），可以根据分子大小纯化circRNA。HPLC具有高选择性、高灵敏度和大规模生产circRNA的能力，纯度通常超过90%。此外，离子对反相高效液相色谱（IP-RP-HPLC）和尺寸排阻高效液相色谱（SEC-HPLC）可进一步提高分辨率，分离粒径差异极小的小片段。

（2）体内合成

将质粒DNA递送到靶细胞，表达线性RNA后通过反向剪接或自催化转录后切割等机制产生circRNA（图3）。互补内含子可在体内实现92%的外源转录物的环化，与体外合成相当。基于PIE、发夹核酶、tRNA内含子剪接等策略可进行体内circRNA表达。然而，这种方法可能导致高水平的线性前体，从而限制环化效率。

图3 在体内合成工程化circRNA。

Tornado系统使用经过优化的Twister核酶进行自催化裂解，生成含有2 ‘,3 ‘ -环磷酸和5 ‘ -OH的靶RNA，并进一步由内源性RNA连接酶RtcB连接。

优势：快速RNA切割，高效环化，高水平表达，短时间可产生大量的circRNA，可应用于circRNA适配体和引导RNA的体内表达。

体内合成circRNA劣势：

①难以大规模生产：依赖于载体传递，大规模工业生产过程中从大肠杆菌等生物体纯化载体难度较大。

②难以保证安全性：利用病毒载体平台，质粒DNA可能整合到基因组中并诱导强烈的免疫反应。

③难以评估剂量：工程化circRNA的体内表达缺乏精确的剂量控制。circRNA表达质粒的线性剪接产物也可编码蛋白质，可能导致产生副产物和circRNA的定量误差。

④难以控制定位：工程化circRNA疗法的精确亚细胞定位对于实现其预期功能至关重要。然而，circRNA的核输出和细胞器运输机制尚不完全清楚，难以确保在靶细胞器上正确的亚细胞定位。

在Covid-19大流行的推动下，RNA疫苗和药物的快速发展使FDA批准了基于mRNA的疫苗用于临床。circRNA在疾病防治方面也有广泛的应用。mRNA的疫苗和疗法的广泛应用仍然受到稳定性低、表达时间有限和潜在免疫原性等因素的限制。线性mRNA需要额外的核苷酸修饰来维持稳定性，而circRNA由于缺乏5’和3’端，在哺乳动物细胞中抵抗核糖核酸酶的消化，其半衰期甚至比线性RNA长2.5倍。

传染病疫苗

在血液样本中，环状RNA的半衰期（24.56±5.2小时）明显长于mRNA（16.4小时）^[1]，更高的稳定性促进了高效和持久的蛋白质翻译^[2]。使用稳定和半衰期更长的环状RNA也可降低储存和运输的成本。

circRNA具有作为传染性疾病疫苗的优势，如利用LNP-circRNA SARS-CoV-2疫苗在小鼠和恒河猴中比1mΨ-mRNA和未修饰的mRNA具有更好的疗效和热稳定性^[3]；LNP递送编码5个VFLIP-X蛋白的circRNA可诱导强大的激素和细胞免疫反应，在小鼠中提供对传染性SARS-CoV-2突变株株的保护^[4]；甘露糖修饰LNP可增加冻干过程中的稳定性，有利于RNA药物长期储存和运输，该方法制备的circRNA疫苗可用于靶向淋巴结中的树突状细胞和B细胞，在小鼠中产生更强的抗体反应^[5]；CircRNA疫苗也被设计用于编码金黄色葡萄球菌的各种表位，以防止感染^[6]。

circRNA肿瘤疫苗

CircRNAs也可通过表达肿瘤抗原而被设计用于免疫治疗和癌症疫苗，如circOVA疫苗可在黑色素瘤小鼠模型中可通过增强TCR-T细胞的持久性，完全抑制晚期免疫排他性肿瘤，诱导抗肿瘤作用。经过IRES、HRV-B3（启动翻译）、5 ’ poly(a)结合蛋白和HBA1 3’ UTR序列（提高翻译效率）设计的circOVA癌症疫苗在递送时激活树突状细胞并触发T细胞应答，可通过改变黑素瘤小鼠模型中的电荷释放转运体。^[7]

circFAM53B编码抗原肽circFAM53B-219可作为肿瘤特异性抗原，在黑色素瘤和乳腺癌小鼠模型中诱导强烈的抗肿瘤免疫反应并抑制肿瘤生长。^[8]由circFAM53B的天然IRES启动的抗原肽circFAM53B-219在体内的翻译可能会受到生理环境复杂性的阻碍。因此，外源性IRESs和翻译调控元件能否构建编码内源性肿瘤特异性抗原、具有更高翻译效率和抗肿瘤应答的circRNA肿瘤疫苗还有待进一步研究。

circRNA蛋白替代疗法

基于circRNA的技术也被开发用于蛋白质替代疗法，针对由罕见疾病引起的特定蛋白质缺乏。如，用LNP递送表达NGF的circRNA，可显著提高视网膜神经节细胞的存活率，效果远优于重组NGF蛋白治疗^[9]；单剂U-LNP/VEGF-A circRNA制剂及可原位长效表达和释放VEGF-A，治疗糖尿病小鼠创面，效果显著优于线性VEGF-A mRNA和rhVEGF。^[10]

circRNA作为潜在的治疗靶点

circRNA在各种器官中的广泛存在引发了人们对利用它们作为治疗剂的兴趣。下调circRNA的恢复可调节重要器官的疾病进展，如大脑、肝脏、胃、乳房和肺部（原文中表格有详细汇总）。如在人类胶质瘤组织中下调的circHEATR5B包括一个编码881氨基酸（aa）蛋白，该蛋白具有肿瘤抑制活性，可抑制相应的异种移植物，延长裸鼠的存活时间。^[11]在肝细胞癌中，核定位circASH2作为YBX1、hnRNPs和原肌球蛋白4 （TPM4）转录物复合物的支架，在体外和体内通过改变肿瘤细胞骨架结构导致其降解，进而抑制转移。^[12]

值得注意的是，相同的circRNA可能在不同的细胞或疾病中发挥不同的功能，这可能引起了基于circRNA的疫苗或疗法临床应用的安全性问题。

circRNA疗法优化

作者预计，基于circRNA的传染病疫苗将是首批从实验室过渡到工业规模生产的疫苗之一。首先，circRNA疫苗体外生产和体内翻译的关键元件，包括驱动翻译的IRES和提高翻译效率的调控元件已被广泛表征。首创的SARS-CoV-2和RABV circRNA疫苗也可以用作案例，以缩短开发周期并降低成本。

体外生成的circRNA疫苗的一般设计和递送载体可适用于其他传染病；然而，编码抗原的ORF序列及其相应进入位点（如IRES）、驱动翻译起始和提高翻译效率的特异性修饰和调控序列，需要进一步研究和优化，以提高抗原的表达效率。此外，与线性mRNA类似，应仔细评估体外circRNA疫苗的给药周期和有效剂量，以确保强大的免疫应答，同时最大限度地减少副作用。

此外，全长circRNA测序策略和基于人工智能的生物信息学算法的进展可促进抗原编码circRNA的合理设计和优化，潜在地解决与内源性在不同疾病表现不同功能的circRNA相关的安全问题。例如，RNA语言模型已被用于识别未注释的IRES并优化用于mRNA翻译的5 ‘ UTR。此外，深度学习模型促进了新的功能性核糖酶的设计，这一策略可提高circRNA的稳定性和翻译效率。然而，由于可用于模型训练的实验验证的环状RNA数量有限，挑战仍然存在。

工程化circRNA已被用于各种应用，体外和体内生产方法的设计改进和优化使环状RNA成为治疗应用的多功能候选物。尽管对基于circRNA的药物的兴趣和大量投资不断增加，但该行业仍处于早期阶段（表1）。

例如，中国circRNA相关企业：吉赛生物（Geneseed）专注circRNA创新疗法CRO服务；环码生物（CirCode）专注传染病疫苗、个性化肿瘤疫苗、蛋白替代与免疫等circRNA药物开发；圆因生物（Therorna）致力于感染性疾病、代谢性疾病和肿瘤等circRNA疗法开发……

国外circRNA相关企业：瑞典的Circio专注于癌症基因治疗、疫苗、罕见病等circRNA疗法开发；韩国的NuclixBio专注于环状RNA药物递送方法开发；美国的Orna Therapeutics致力于开发B细胞介导的自身免疫性疾病、B细胞恶性肿瘤、镰状细胞疾病、β-地中海贫血、感染性疾病和其他疾病的circRNA疗法……

表1 circRNA的企业实例

优化设计和生产：优化环化和纯化等circRNA生产步骤，保证大规模生产的成本效益；确定提高环化效率的核酶，支持大规模工业生产；人工智能模型开发，帮助发现增强circRNA持久翻译的元件。

优化递送系统：强大的递送系统有利于circRNA疗法特异性靶向组织或细胞作用，规避体内免疫反应和避免降解机制。靶向性纳米脂质颗粒（LNP）、金属有机框架、外泌体都是有前景的circRNA递送系统。

多方面考虑给药剂量：环状RNA半衰期更长，可能通过Ago-2、核酸内切酶，m⁶ A修饰，环状RNA结构和三甲胺- N -氧化物（TMAO）等介导降解，但具体机制仍未明确。因此，临床应用中circRNA治疗药物的剂量必须考虑到各种降解途径。

circRNA在生产、递送和治疗效果方面具有优势，是RNA治疗的重大突破口，可能促进下一代疫苗、罕见疾病治疗、抗癌药物等产品的出现。circRNA基础研究及药物研发的进一步推进，有望使环状RNA将成为疫苗开发和制药行业首选的RNA平台。

https://www.nature.com/articles/s44222-024-00259-1

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