circRNA作为一类非编码RNA，与疾病的发生发展密切相关，可作为癌症等疾病的生物标志物。不同于其他线性RNA，circRNA具有特殊的闭合环状结构，利用RT-PCR等传统方法检测会由于逆转录酶的链置换潜力，导致circRNA丰度被高估，难以对其进行准确检测。
2024年10月1日，中山大学王佳思课题组在Biosens Bioelectron发表文章Quantitative detection of circular RNA and microRNA at point-of-care using droplet digital CRISPR/Cas13a platform。该研究团队致力于开发数字式核酸检测方法，曾开发了数字式超支滚环扩增（ddHRCA）实现circRNA绝对定量检测（Sensors Actuat B-Chem. 2023, 375, 132893）。但该系统依然需要复杂的微流控设备，同时基于聚合酶扩增的方法容易产生交叉污染等假阳性信号。
本研究中作者开发了一种基于多分散液滴数字CRISPR/Cas13a（Polydisperse droplet digital CRISPR/Cas13a, PddCas13a）定量检测circRNA，并开发了一种自动化便携式仪器，实现circRNA现场自动化检测。CRISPR/Cas13a可以特异性结合circRNA的连接位点区域（BSJ）序列，反应过程不需要聚合酶扩增，避免交叉污染风险。通过结合液滴的限域效应实现目标circRNA的精准定量分析，该方法具有高特异性与灵敏度，且不需要专业的设备，适用于现场检测，为circRNA检测提供了一种简单有效的方法。该方法也可以应用于mircoRNA (miRNA)检测。
1. 反应原理
在CRISPR/Cas13a体系中，CRISPR RNA （crRNA）只有在与目标RNA互补结合后，Cas13a才会被激活，激活的Cas13a表现出反式酶切活性，即可以非特异性切割报告RNA从而产生荧光，并根据荧光信号对反应进行实时监测。circRNA具有独特的连接位点BSJ，crRNA被设计为与BSJ完全互补，因此该体系只有目标circRNA存在情况下才会产生荧光信号，保证反应特异性。在PddCas13a中，通过将反应溶液快速分离为大量“油包水”微米级液滴，液滴限域效应能够提高circRNA局部浓度，在含有目标circRNA的液滴中，Cas13a被激活并产生荧光信号，而不含有目标circRNA的液滴则没有荧光信号。利用荧光显微镜记录阳性液滴与总液滴的数量和体积，利用统计计算实现靶RNA的定量检测，该方法能够有效提高低丰度RNA检测的灵敏度和定量准确性。
图1 PddCas13a检测circRNA与miRNA
2.系统验证及优化
环状RNA circHIPK3（hsa_cir_0000284）是HIPK3基因外显子2的剪接产物，长度为1099个核苷酸。circHIPK3在癌细胞中上调并发挥作用，可以作为癌症标志物，本工作中作者选用circHIPK3作为靶点开展研究。作者首先对比了Cas13a与Cas12a反应体系检测circRNA的性能。Cas12a只能识别并检测DNA，因此需要将circRNA逆转录产生单链cDNA。通过对比两个反应体系，Cas13a反应体系的荧光信号显著高于Cas12a（图2a），因此作者接下来直接使用Cas13a检测circRNA。
由于circHIPK3过长，难以高纯度合成。为了获得标准品，作者以包含circHIPK3连接位点及两侧序列的较短circRNA（sub-circHIPK3）作为替代，并证明sub-circHIPK3可以与同源线性RNA进行区分（图2b）。随后作者优化了Cas13a-crRNA、报告RNA、Mg2+浓度和反应温度等实验条件（图2c），优化后Cas13a对sub-circHIPK3的检测限分别约为1 pM（图2d）。
图2 Cas13a直接检测circRNA并优化反应条件
3. PddCas13a定量检测circRNA
为了提高检测灵敏度，作者将反应体系分散至油包水液滴中，每个液滴中包含数量不等的靶circRNA，孵育后在荧光显微镜下采集液滴荧光信号（图3a）。实验证明PddCas13a可以区分circRNA和同源线性RNA，具有良好的特异性（图3b），且能够与miRNA进行区分（图3c）。接下来作者用PddCas13a定量检测了sub-circHIPK3，得到PddCas13a检测限低至10 aM，并用统计模型校正了量化结果（图f）。
图3 PddCas13a定量检测circRNA
4. PddCas13a在真实样品中定量检测circRNA
在真实样品检测中，作者发现crRNA可能被样品中核酸酶降解并影响Cas13a的活性。因此作者对野生型crRNA（WT-crRNA）进行硫代磷酸（PS）修饰，得到修饰的crRNA（MD-crRNA）（图4b）。作者并证明MD-crRNA能够避免核酸酶降解并提高真实样品检测效果（图4c，d，e）。随后作者使用MD-crRNA结合PddCas13a检测了五种细胞的总RNA中circHIPK3的浓度，结果与数字PCR（ddPCR）的结果相一致，证明了该方法的可靠性（图4f，g）。
接下来作者利用PddCas13a检测癌症患者血清外泌体中的circHIPK3，评估其癌症诊断效果。结果表明癌症病人外泌体中circHIPK3表达含量明显升高，证明PddCas13a对复杂生物样品中的circRNA具有良好的定量检测能力（图4h）。
图4 PddCas13a定量检测真实样品中的circHIPK3
5. 适用于PddCas13a的便携式检测仪器
为了简化工作流程和操作，作者设计并建立了一种便携式仪器，该仪器由液滴生成模块、加热模块和光学成像模块组成，可以现场自动化检测circRNA，减少手动操作（图5a）。其工作流程为：将油和反应溶液加载到载玻片上，通过控制程序产生液滴，等温孵育后，获得荧光图像（图5b）。该仪器能够在阳性样品中清楚地检测到液滴中的荧光信号（图5c）。作者使用该装置检测含有不同浓度circHIPK3的血清外泌体样本，结果与手动检测的结果一致（图5d）。这些结果证明使用PddCas13a便携式平台可以应用于现场circRNA的定量检测。
图5 利用PddCas13a便携式检测仪器定量检测circRNA
6. 总结
本研究基于CRISPR/Cas13a系统，通过直接识别BSJ区，在恒温下实现了circRNA检测，并通过与液滴数字式检测方法结合，实现高灵敏度定量检测circRNA。多分散液滴检测方式避免了传统液滴制备对微流控芯片设备的依赖，极大降低了人力、物力和时间成本。此外，本研究提出的方法从原理上具有高特异性，且免扩增的检测方式从根本上避免了交叉污染风险。通过结合便携式检测仪器，可以实现circRNA现场定量检测。本研究技术未来有望应用于癌症等重大疾病早期诊断。
原文链接
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956566324008327?via%3Dihub