潜在的衰老靶点包括uPAR受体和NKG2D配体。虽然抗衰老药物在各种慢性疾病中具有临床前潜力，但衰老细胞标志物的特异性仍然具有挑战性。而CAR-T和巨噬细胞的高特异性优势使其具有治疗衰老的潜力。
与传统的体外CAR – T细胞疗法相比，基于mRNA的体内CAR-T细胞工程在治疗炎症性衰老方面具有潜在的优势：无需复杂和昂贵的体外细胞处理；短暂性表达避免了基于病毒载体的永久性基因组改变风险；有助于减轻细胞因子释放综合征和CAR- T细胞持续激活导致的脱靶等不良反应。
CAR mRNA可通过抗体靶向脂质纳米颗粒（tLNPs）或聚合纳米颗粒递送至T细胞。虽然抗体靶向有效，但扩大生产规模过程中，确保批间重复性、抗体修饰程度和偶联率具有挑战性。不当的抗体也可能加速LNP降解或导致靶细胞过度活化。相比之下，非靶向LNP更容易制造，安全性更高。一些脂质制剂，如金刚烷胺衍生的阳离子脂质，具有对T细胞和B细胞的内在趋向性，这表明其可在不需要抗体偶联的情况下，改善免疫细胞靶向性的潜力。
2024年11月22日，上海环码生物医药有限公司（CirCode）杨赟联合北京大学邓觅、苗蕾研究团队在预印本BioRxiv上发表研究论文：Cardiolipin-mimic lipid nanoparticles without antibody modification delivered senolytic in-vivo CAR-T therapy for inflamm-aging。
研究设计了含有新型拟心磷脂磷酰胺（CAMP）脂质的LNP，增加了硬度和相分离，促进T细胞偏向性摄取。此外，环状RNA（circRNA）表达CAR蛋白，可增强脾靶向性并延长表达时间。研究利用含CAMP的LNP包封的抗uPAR CAR蛋白circRNA，可在单核/巨噬细胞和衰老成纤维细胞中有效表达，具有治疗肝纤维化和类风湿性关节炎（RA）的潜力。研究还设计和筛选人源抗uPAR抗原CAR，有望促进治疗炎症性衰老的体内CAR-T疗法的临床转化。
主要研究结果
构建CAMP脂质文库，递送RNA至原代人T细胞
心磷脂是线粒体内膜的主要成分，在膜折叠和曲率形成中起着至关重要的作用（图1A）。研究以心磷脂为起点，开发一个修饰阳离子脂质文库。
通过修饰带负电荷的心磷脂双磷酸基团，得到一个由23种纯化的可电离阳离子脂质组成的库，称为拟心磷脂磷酰胺（CAMP）脂质（图1B）。纯化后的CAMP脂质与二油基磷脂酰乙醇胺（DOPE）、胆固醇和C14-PEG配制成LNP配方。利用CAMP LNP包封编码mLuc的mRNA，鉴定出7个LNP在原代人T细胞中显著提高荧光素酶的表达。与阳性对照相比，PL101、PL40和PL67 LNP的表达增加了100倍以上（图1C）。
图1 建立用于原代T细胞RNA递送的CAMP脂质文库。
结构和形态影响PL40 CAMP LNP向T细胞传递mRNA
然后利用CAMP脂质转染各种类型的细胞（图2）。T细胞是优先表达PL101和PL40 LNP递送的mRNA的主要细胞类型之一（图2b）。PL40转染率最高，超过90%的细胞在超过0.5 μg的剂量下表达GFP（图2D）。
研究基于II型内含子的自剪接策略合成circ mLuc，FPLC纯化后，利用CAMP包封Circ mLuc。在人原代T细胞中，与线性对应物相比，Circ mLuc在5天内延长蛋白表达（图2E）。
CAMP制剂在增加剂量后均未观察到对T细胞的毒性（图C）。PL40 LNP具有最佳等离子体稳定性，类似于商用ALC0315 LNP（图2F）。最终，PL40被选为主要候选脂质。
使用冷冻透射电镜（Cryo-TEM）检测显示，而PL40表面为高度多面体，具有更薄的片层结构和更致密的颗粒核，这可能是不同脂质结构域相分离的结果。这种相分离可能会促进与T细胞膜的融合。
SAXS实验（图2H）结果表明，在T细胞中mRNA表达增强的PL40、PL101和PL67的d间距较小（~3 nm），可能是由于脂质和mRNA的堆积更紧密。
原子力显微镜（AFM）评估发现，与ALC0315和PL15 LNP相比，PL40 LNP的弯曲模量明显更大。PL40 LNP独特的表面形态和较高的膜弯曲模量有助于改善T细胞的细胞摄取。
与ALC0315 LNPs相比，原代T细胞对PL40摄取增加了2倍，ALC0315 LNP受到肌动蛋白取向和微胞吞噬的影响（图2J和K）。PL40多链核心结构也可能促进膜融合和质子化后的内体释放。综上，PL40的形态和结构是促进T细胞内吞和内体逃逸的原因之一（图2K）。
图2 结构和形态影响PL40 CAMP LNP向T细胞传递mRNA。
PL40 LNP在体内向T细胞递送mRNA
研究给C57小鼠分别静脉注射药物，结果表明不同于ALC0315的主要在肝表达，PL40 LNP递送Lin mLuc促进了脾脏的优先表达，脾肝比为2.63；递送Circ RNA有利于脾脏表达，脾肝表达比例比Lin组增加了两倍（图3B），并在脾脏中的表达时间延长。
研究在基因工程小鼠模型中进一步验证，发现相比线性RNA，Circ mCre的脾脏T细胞转染率明显更高（~20%）。与非靶向LNP（约10%转染率）相比，修饰靶向性抗体的CD3-Fab增加了T细胞的靶向性（约20%），但这种优势在脾脏和血液中并不明显。结果表明PL40 LNP在体内和体外都能有效地将mRNA递送到T细胞（图3F）。
研究还发现，CD3 fab修饰的LNP在CD4 T细胞中，Tim-3的表达增加了三倍，表明T细胞有耗竭的趋势（图3H）。
图3 mRNA LNP向免疫细胞的体内递送。
PL40 LNPs将T细胞有效改造成CAR – T
研究构建四种类型的mRNA CAR（图4A-B）：编码人类CD3-CD28细胞内结构域（hCD19-hCAR）的典型白血病特异性1928z CAR，和编码抗小鼠和人类uPAR的单链可变片段（scFv）（muPAR-hCAR）的circRNA；编码的小鼠CD3-CD28细胞内结构域（muPAR-mCAR）的Lin和circRNA。
在小鼠T细胞中，与Lin mRNA（转染效率为80%）相比，muPAR-mCAR Circ mRNA在孵育24小时后的转染效率更高（99%）（图4D）；circRNA CAR蛋白平均强度比Lin mRNA约高10倍；表达也持续了更长的时间：约15%的细胞在5天后仍然表达CAR；而Lin mRNA在2天内下降到<5%（图4D）。
表达hCD19-hCAR和muPAR-hCAR的T细胞分别选择性地裂解约90%或60%的抗原阳性靶细胞（hCD19-hCAR为B细胞，muPAR-hCAR为3T3-uPAR细胞），表明这两种CAR都具有细胞毒性功能（图4E&F）；转染了muPAR-mCAR Circ RNA的小鼠的CAR – T细胞在E：T比为40时裂解了>95%的3T3-uPAR细胞（图4G&H）。
图4 PL40 LNP有效地将T细胞改造成CAR-T细胞。
muPAR-mCAR PL40 LNP增强对肝纤维化的疗效
研究采用CCl4诱导肝纤维化模型，评估编码CAR-uPAR的circRNA PL40 LNP的体内治疗。治疗后小鼠肝损伤减轻（图5B），有效消除了促炎衰老的肝星状细胞（HSC）（图5C）。非Fab修饰LNP处理组肝脏中uPAR水平降低了约4倍，低于CD3-Fab修饰的LNP（图5C、D），且T细胞有活化的趋势。而添加CD3-Fab增加了T细胞衰竭。综上，非Fab修饰的LNPs具有更好的抗肝纤维化功效。
图5 muPAR-mCAR LNP在CCl4诱导肝纤维化模型的抗纤维化作用。
与PBS组相比，CAR-T治疗后抗炎微环境持续存在。总之，这些结果证明了非Fab修饰的CAR-uPAR LNP可有效治疗肝纤维化。
图6 CAR-T细胞在肝纤维化治疗中的功能评价。
体内muPAR-mCAR PL40 LNP疗法提高类风湿关节炎的疗效
uPAR在类风湿关节炎（RA）的发病机制中也具有多因子作用。研究分析了公共数据库中RA患者滑膜的相关Bulk RNA-Seq和scRNA-Seq数据，发现uPAR在成纤维细胞和单核细胞中高度表达（图7A）；在基质细胞和髓细胞中，uPAR与多个衰老相关因子共定位（图7A）。
研究建立胶原诱导关节炎（CIA）小鼠模型，验证抗uPAR体内CAR-T疗法的有效性（图7B），结果表明CAR-muPAR PL40 LNP治疗可以编辑和动员T细胞，杀伤CIA小鼠关节中显示uPAR的衰老细胞，而不引起炎症，从而有效地重建关节免疫稳态。
图7 muPAR-mCAR LNPs治疗胶原性关节炎的体内疗效。
筛选优化人源CAR-uPAR mRNA用于临床应用
研究从6万多个小鼠杂杂瘤克隆中，筛选两种高亲和力的抗人uPAR的小鼠单克隆抗体（图8a和b）， AB4的VH2+VL1组合CAR（CAR#4）和AB20的VH1+VL2组合CAR （CAR#20）（图8G）。
研究靶向uPAR+ AGS和THP-1细胞，发现相比基于LinRNA和慢病毒表达的CAR#20，circRNA的CAR#20表现出更好的细胞毒性，而且基于circRNA的抗人uPAR CAR-T细胞疗法也可强效和特异性地消除uPAR+靶细胞方面也具有强效和特异性，这为进一步的临床转化提供了潜力。
图8 uPAR单克隆抗体的制备及uPAR CAR-T细胞的构建。
总结
研究设计含有新型CAMP脂质的LNP，包封环状RNA，延长了脾脏和T细胞中的蛋白表达。团队用筛选得到的PL40 LNP，体内递送编码抗uPAR（衰老和炎症抗原） CAR的circRNA，有效减轻uPAR相关的肝纤维化和类风湿性关节炎。为了进一步加强临床翻译，研究还筛选并人源化了针对uPAR的scFv，建立了编码人源抗uPAR CAR的circRNA PL40 LNP。
该研究基于circRNA和新型CAMP脂质的LNP建立了靶向脾脏和T细胞的体内CAR治疗策略，具有治疗炎症性衰老疾病，如类风湿关节炎和肝纤维化的潜力。
原文链接
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.11.21.624667v1