bioRxiv丨超滤纯化工程化circRNA，大幅提升纯度及产率

环状RNA（circRNA）因其闭环结构而免受外切酶介导的降解，可提高治疗性蛋白表达的稳定性、持续时间和丰度，可有更好的疗效。此外，在人体内的天然circRNA在整个生物学和疾病领域都发挥着作用。为更好地了解circRNA多样化的生物学中所起的作用，获得高产量纯circRNA的工具将是生物医学研究的必要条件。

circRNA可以通过连接体外转录（IVT）前体形成，circRNA合成产物中含有质粒DNA模板、残余preRNA、缺口（nicked）RNA和circRNA。circRNA的蛋白表达稳定性在很大程度上取决于纯度，preRNA和nicked RNA杂质会诱导强大的细胞免疫反应。因此，必须纯化circRNA以去除这些杂质。

IVT circRNA的主要纯化方法

凝胶电泳用于分离具有不同迁移速率的RNA构象（preRNA、nicked RNA和circRNA）。然而，分离过程中的加热可能会损害RNA的稳定性并降低产率，且电泳方法是不可扩展的。

使用RNase R，利用circRNA的稳定性和对外切酶的抗性，可以分解线性RNA，富集circRNA。然而，在高RNase R浓度下，circRNA可能会出现缺口并降解，而且酶的高成本使其不适合大规模生产。

尺寸排阻高效液相色谱（SE-HPLC）根据分子量和极性的差异分离RNA分子，是去除内含子的好方法。然而，当分离大小高度相似的RNA构象时，峰重叠，选择性很低。为了获得高纯度，需要严格选择窄峰馏分，会导致回收率降低。

因此，开发circRNA新疗法需要新的可扩展的分离方法，以达到高纯度，同时产生足够高的产量，使其适合大规模生产。

中国科学院纳米生物效应与安全性重点实验室曹宇虹团队利用纤维素过滤去除dsDNA，结合酶处理的逐步纯化策略，用于circRNA纯化，显著提高circRNA回收率，降低免疫原性。

中国食品药品检定研究院徐苗团队建立RT-HPLC纯化法，明显分离circRNA、nicked RNA和precusorRNA，用于分析circRNA疫苗纯度及降解产物。

西班牙 Certest Biotec S.L公司团队在circRNA序列中添加PloyA，利用Oligo dT亲和层析技术纯化circRNA，得到circRNA的占比更高，且在细胞水平和体内的表达效果均优于kit试剂盒以及HPLC纯化得到的circRNA。

超滤（UF）方法可以利用线性DNA通过UF膜的临界通量低于超螺旋和开放的环状异构体，纯化质粒DNA，也可能适用于纯化circRNA。

2024年12月4日，美国克莱姆森大学Scott M. Husson研究团队在预印本bioRxiv上发表研究论文：Purifying circular RNA by ultrafiltration。研究探索了超滤（UF）从IVT产物中纯化circRNA，并获得高纯度和产率的方法。

研究使用用分子量从30到300 kDa的聚醚砜（PES）膜测量了circRNA、线性preRNA和nicked RNA的筛分系数（一种分离度量），分析了渗透通量的函数性能，估计了RNA的临界通量，并确定了合适的纯化操作条件。研究突出了超滤在研究规模上是一种优越的circRNA纯化方法，也可以在基于circRNA的治疗药物的大规模生产中发挥关键作用。

图1 UF过滤装置

circRNA合成和凝胶分离

研究采用张元豪教授团队^[1]的方法体外合成circRNA，然后通过凝胶电泳，鉴定出了circRNA、preRNA和nick RNA对应的三个条带（图2A）。IVT产物用RNase R处理，以确认合成了circRNA，并确定circRNA对应的E-胶带。使用凝胶RNA提取获得纯化的circRNA、preRNA和nick RNA用于超滤研究（图2B）。

图2 circRNA合成及凝胶纯化。

RNA水动力直径测量

超滤可以根据核酸的大小和形状进行分离。过滤前，分子呈球形；过滤开始时，在孔入口附近形成的会聚流场使分子伸展。在足够高的渗透通量下，分子从球形转变为完全伸展的形状。这种形状的变化使分子能够通过超滤膜。这个点称为临界通量。一种有效的超滤膜可以使分子以完全伸展的形状流过。

因此，为了选择合适的膜，研究测量了RNA的动态光散射（DLS）值，即RNA分子为球形时的水动力直径（表1）。假设RNA分子以完全伸展的形状流过膜，因此研究选择截留分子量（MWCOs）小于所有RNA构象的动态直径的膜。（表2）

研究通过准确的流速测量，结果显示在相同压力范围内选择较低的MWCO会降低渗透率。（图3）

图3 渗透率对膜分子量在10-70 kPa范围内的相关性，MWCO越高，渗透率越高。

超滤测量

筛分系数(S)量化了渗透液中溶质浓度与通过膜的进量之间的比率。当S等于1时，溶质自由地流过膜。当S等于零时，膜完全保留溶质。筛选系数结果表明，Biomax PES 30kda的膜可以分离circRNA与preRNA和nick RNA（图4-5）。在所有测试的通量值中，circRNA的S都很低（低于0.06），这表明在低通量值下，大多数circRNA保留在膜上。当通量高于200µm/s时，nicked和preRNA的筛分系数显著增加。

虽然临界通量之间的差异很小，但在较高通量值下，circRNA的筛选系数明显低于preRNA和nicked RNA的筛选系数。circRNA的低筛分系数接近恒定，这可能是由于膜中孔径的分布，而不是由于流动引起的变形，其中一小部分circRNA分子可以通过其中较大的孔。

图4 纯化circRNA的初步筛选系数采用Biomax PES 300 kDa，100 kDa和30 kDa膜。选用30 kDa膜，因为其渗透性接近于零。

图5 使用30k Da的Biomax膜对circRNA、nicked RNA和preRNA的纯化组分进行筛分系数测量。蓝色部分表示研究要进行超滤的通量范围。

在此条件范围内，较低通量的纯度和产率将在60%以上，较高通量的纯度将在95%以上，产率约为50%。

二元净化测量

研究超滤circRNA和preRNA混合物，得到circRNA纯度为95%，产率为62%。当压力为414 kPa时，渗透通量从310µm/s降至274µm/s（图6）；超滤circRNA和nicked RNA混合物，获得circRNA纯度为80%，产率为50%（图7）。在实验过程中，通量从355µm/s下降到272µm/s。因此，通量下降对分离选择性的影响更为显著。

图6 circRNA和preRNA混合物的滤过。

图7 circRNA和nickedRNA二元混合物的滤过。

三元混合物测量

在超滤三元混合物的研究中，经过四次超滤，得到circRNA纯度为96%，得率为53%，通量从425µm/s下降到350µm/s。（图8）

图8 circRNA（44.4%）、preRNA（23.8%）和缺口RNA（31.8%）的三元混合物在高于preRNA和缺口RNA临界通量的条件下滤过。

IVT产物超滤与SE-HPLC比较

研究对IVT产物溶液，进行四次超滤，获得circRNA纯度为81%，产率为65%（图9）。通量由334µm/s降至258µm/s。所获得的纯度不如三元混合物的分离，这可能与内含子、残留核苷酸和DNA模板等杂质有关。

图9 将含有circRNA（31.9%）、preRNA（37.5%）和缺口RNA（30.7%）的稀释IVT溶液在高于preRNA和缺口RNA临界通量的条件下滤过。

图10 SE-HPLC纯化含有circRNA (31.9%)，preRNA（37.5%）和nicked RNA（30.7%）的稀释IVT溶液。

总结

研究探索了超滤法作为circRNA的替代纯化方法，并获得了比SE-HPLC更高的纯度和产率，纯度约为SE-HPLC的两倍，得率在50%以上。此外，相对容易的超滤过程的缩放，使其有望成为工程化circRNA纯化方法。需要克服的挑战是，mAU留存时间（min）由于膜污染和浓度极化引起的通量下降，导致的运行过程中筛分系数变化。该研究的结果可能会提高基于circRNA的医学治疗和疫苗的可及性。

原文链接

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.12.04.626383v1

参考文献

[1] Chen, R., et al., Engineering circular RNA for enhanced protein production. 2022, Springer US.

高纯度circRNA的体外合成

吉赛生物拥有RNA环化专利技术，分别为基于I型内含子自剪接法circPrecise^®和基于T4连接酶法的circPure^®，可实现精准高效的circRNA体外环化。此外，吉赛生物通过分析IVT circRNA产物杂质组分和含量，采用多种针对性层析纯化策略；再使用RNase R辅助纯化，所用的RNase R为吉赛生物自主研发，经过优化的RNase R消化能力更强、效率更高、综合性能更佳，用于IVT circRNA产物纯化可降本增效。