天然环状RNA（circRNA）可作为miRNA和蛋白质的海绵，也可作为翻译模板；设计序列体外合成circRNA可在体内稳定长效翻译蛋白。circRNA由于其闭环结构可抗外切酶，比mRNA更稳定，因此有望替代mRNA用于治疗。
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CircRNA可通过化学或酶连接或利用核酶的方法在体外合成。然而，化学或酶连接法难以实现大片段RNA的环化，也不能完全避免分子间末端连接的副反应。基于I型内含子的排列内含子-外显子（PIE）法可有效生成circRNA。但PIE法也有一定限制，如长片段RNA的环化效率较低，残留的细菌序列具有免疫原性，且无法合成修饰的circRNA。韩国Rznomics公司自主研发的基于嗜热四膜虫（Tetra）I型内含子衍生的STS RNA环化平台，利用反式核酶端对端的自靶向和自剪接反应高效合成circRNA。
2024年12月13日，英国MRC分子生物学实验室（MRC-LMB）Venki Ramakrishnan（2009年诺贝尔化学奖得主）团队在Nature Biomedical Engineering发表研究论文：Efficient circular RNA synthesis for potent rolling circle translation。研究开发了另一种基于反式核酶的环化方法（TRIC）。
TRIC方法采用了鱼腥藻tRNA来源的I型内含子，利用其内部引导序列（IGS）与侧翼外显子的相互作用拉近P1和P10，将靶序列连接到反式核酶的3’端，从而产生circRNA（图1）。研究利用优化的TRIC法有效合成超过8,000 nt的circRNA，产生的circRNA免疫原性较低，可进行完全RNA修饰，翻译效率更高，设计合成circRNA，使滚环翻译效率提高7,000多倍。CircRNA的有效设计和合成可促进其临床治疗应用。
图1 TRIC的设计。
TRIC可以有效地合成circRNA
I型内含子可作为反式核酶，当目标序列连接到核酶的3 ‘端，就会发生剪接反应产生circRNA。这种TRIC方法使完整的核酶保持在目标序列的上游，从而允许整个核酶的有效局部折叠。
研究选择鱼腥藻tRNALeu I型内含子，因为它更短，且更活跃。内含子位于tRNA反密码子臂（ACA）中，并利用其内部引导序列（IGS）与侧翼外显子的相互作用拉近P1和P10，将靶序列连接到反式核酶的3’端，从而产生circRNA。延长引导序列（EGS），及EGS与IGS之间的内部环是提高反式核酶效率的关键。研究通过引入20或23 bp的EGS和内部环构建TRIC-V1.0。（图2）
合成>8,000 nt的circRNA
TRIC-V1.0构建体对EGFP-柯萨奇病毒B3 （CVB3）、萤火虫荧光素酶（Fluc）、SARS-CoV-2的刺突蛋白（spike）和Cas9的共转录剪接效率都显著高于PIE法。优化Mg2+离子浓度、温度等共转录剪接条件，可有效环化多个GOI，包括8,706 nt的人凝血因子VIII。（图2）
图2 TRIC有效合成circRNA。
circRNA鉴定
天然琼脂糖凝胶和甲醛琼脂糖凝胶难以将circRNA与其线性前体分开。尿素-聚丙烯酰胺凝胶可有效地将circRNA与线性前体区分开来，但限制在<500 nt。E-凝胶系统可以分离circRNA和线性前体，但具有批次效应。
研究在0.8%、1.5%和3%的天然琼脂糖凝胶上分析了长度从813到5757 nt的circRNA（图3d-f）。随着琼脂糖浓度的增加，相比线性RNA，circRNA的迁移率降低更显著。因此，可以利用天然琼脂糖凝胶充分分离circRNA与其线性对应物。
在6 M-1.5%的尿素-琼脂糖凝胶中，所有测试的circRNA的迁移速度都比线性对应物慢得多（图3g）。降低尿素或琼脂糖浓度减少了分离（图3h，i）。运行时间延长或增加运行功率可以增强分离效果。此凝胶的电泳只需要<30分钟，可成为circRNA鉴定的快速方法。
图3 使用琼脂糖凝胶分离circRNA及其线性对应物。
TRIC-V2合成无残留序列的circRNA
TRIC构建体V1和PIE都依赖于天然自剪切序列，这些序列会残留成为合成的circRNA序列的一部分。因此，研究团队极大缩短了tRNA序列的L15/R30，仅包含P1和P10（V1.30）。
研究再添加R30序列，将环化效率恢复到V1.0水平。对L/R长度进一步优化，得到与V1相同效率的最短序列17 nt ACA。V2至少需要一个扩展的ACA（eACA），包括一个7 nt环，保留GU碱基对的U和一个≥5 bp的反密码子茎，以实现高效环化。（图4）
图4 TRIC-v2使环化而没有多余的序列。
TRIC-V2比PIE效率更高
研究中，茎最长（11bp）的天然circZnf609的环化效率最高（图4d），表明较长的茎会导致更高的环化效率。研究生成茎长为15和25 bp的V2构建体，环化EGFP的效率优于V1（5 bp的茎）。而进一步将EGS延长到40 nt并没有明显提高效率。
TRIC V2构建体合成1,638 nt的EGFP环状RNA时实现了90.3%的产率，即3.7倍于PIE的环化速率。通过进一步优化环化条件，环化效率提高到97.8%，产率提高到74.8%；使用转录后环化策略，V2构建体将PIE法~50%的产率和~20%的缺口率分别优化到65.5%和9.3%。（图5）
图5 TRIC-V2比PIE效率更高。
CircRNA的免疫原性较低
TRIC-V2构建体合成circRNA，然后通过连续三次HPLC纯化和RNase R消化。合成的circRNA免疫原性显著低于未修饰的mRNA，低于或相当于PIE法合成的circRNA。TRIC不依赖于细菌序列，这有助于合成天然环状RNA，相比含有残留序列的PIE法，避免引入细菌序列可能引发的免疫原性。（图6）
修饰circRNA的合成
修饰可能破坏PIE和TRIC的核酶活性，无法合成完全修饰的circRNA。因此，研究团队将I型内含子用作反式切除核酶（TER），这种基于反式切除核酶的TERIC方法可高效合成100%的m6 A和N1 Ψ修饰的circZnf609。这表明，TERIC能够有效地合成完全修饰的circRNA，可进一步降低circRNA的免疫原性，进一步增强circRNA的作用效果。（图6）
图6 circRNA具有低免疫原性。
TRIC合成的circRNA翻译效率更高
TRIC-V2构建体合成circNluc的蛋白表达量高于N1 Ψ修饰的mRNA及PIE法合成的circNluc。（图7）
缺乏终止密码子的circRNA允许核糖体沿circRNA翻译多次，从而产生多聚蛋白，这一过程称为滚动环翻译（RCT）。多聚蛋白可被蛋白酶或自切割序列，在单轮起始中产生多个GOI拷贝。RCT的效率可以是单次翻译的100倍。研究选择CSFV IRES，并设计阅读框构建RCT。与单次翻译相比，circNluc的表达增加了10倍以上，且比使用OR4F17 IRES的RCT效率高出7,000倍以上。（图7）
图7 circRNA的蛋白表达。
总结
研究利用TRIC构建体并抑制共转录环化，大幅提高转录后环化速率，可实现长circRNA的高产量合成。Rznomics公司的STS RNA环化平台类似于仅包含P1和P10的V1.3，体外环化效率受到一定限制。TRIC-V2构建体在最短序列下具有高效的环化效率，同时结合CSFV IRES可将RCT效率提高7,000倍以上，证明了核糖体能够读取复杂的病毒IRES，可能通过主动翻译进一步增强的circRNA的表达稳定性。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41551-024-01306-3
No scar circRNA合成
吉赛生物的circPrecise®RNA环化专利技术是基于I型内含子自剪接法创新升级的，通过对目标线性RNA核酸序列进行再设计，利用RNA自身二级结构，设计最佳环化位点，并去除鱼腥藻内含子自剪切核酶中外显子序列，无引入多余序列，实现了体外转录RNA的精准高效环化。