bioRxiv | 利用oligo（dT）亲和层析法实现circRNA的大规模纯化

以下文章来源于BioFactory ，作者留胡子的豆腐

最近，关于circRNA纯化的文章不断涌现，例如，oligo(dT)亲和层析，超滤，RNase R/纤维素层析/磷酸酶多级纯化。各种纯化方法的详细介绍，在旧文首次采用超滤纯化circRNA，实现高纯度和高回收率，我们做过归纳总结，感兴趣的朋友可点击查看。对于大规模合成纯化circRNA来说，从成本和可行性上来讲，无论是酶法富集，还是超滤，均无法超越亲和层析。

在旧文大规模制备circRNA: 从Oligo dT亲和层析到冻干制剂，首次在circRNA序列中添加PolyA序列，采用oligo(dT)亲和层析纯化得到circRNA。从原文章中关于circRNA纯化方法的描述来看，circRNA中由于存在PolyA，会挂在oligo(dT)柱子上，可用水洗脱下来。关键问题是，线性化的precusor前体中既有本来就存在的poly(AC)间隔序列，又有新添加的PolyA，肯定也会挂在oligo(dT)柱子上。那么到底是如何实现precusor前体与circRNA的分离呢，原文由于是预印本，并未给出详细信息。

OK，沿着上述思路，我们很容易想到解决问题的方法：

• 第一种，在oligo(dT)亲和层析中，让circRNA流穿，而线性杂质RNA挂在柱子上。去除或者替换掉precusor前体中的poly(AC)间隔序列，让circRNA不再具有连续的腺苷酸。相反，给precusor前体序列中添加PolyA尾巴。这样的话，在环化反应产物中，携带PolyA尾巴的线性precusor前体将会结合到oligo(dT)亲和层析柱上面，而circRNA无法结合挂在oligo(dT)亲和层析柱上面，从而流穿。

• 第二种，利用circRNA与线性杂质RNA对oligo(dT)亲和层析填料的结合能力强弱差异，将两者分离。由于oligo(dT)亲和层析结合溶质的原理是基于T-A碱基配对。那么，溶质分子序列中拥有更多的A，将会更加牢固地结合在柱子上，不容易被洗脱下来。这种纯化方法需要梯度洗脱，寻找能够将circRNA和杂质线性RNA分子分离开来的最佳洗脱条件。

2024 年 12 月 27 号，郑州大学基础医学院梅英武团队在 bioRxiv 上传预印本文章：A poly(A) polymerase and oligo(dT)-dependent method for the purification of engineering circular RNAs that enhances protein expression in eukaryotic cells，他们提出了一种 circRNA 的新型纯化策略：poly(A) polymerase and oligo(dT)-dependent purification system(PAPdT)。具体来说，利用 poly(A)聚合酶给基于 I 型内含子合成的 circRNA 合成产物中所有线性 RNA-3’OH 末端添加一段超过 200nt 的poly(A)尾巴，然后，通过 oligo (dT)亲和层析将这些加尾线性 RNA 与 circRNA 分离。带有较长poly(A) 尾的线性 RNA 杂质在oligo (dT)柱上表现出更长的保留时间，而具有较短 poly(AC)间隔序列的 circRNA 洗脱速度更快。这种新型纯化策略要比 RNase R 富集法或者 SEC-HPLC 具有更高的纯度和回收率，更低的成本，非常适合 circRNA 的大规模合成。

   

环化反应产物的多聚腺苷酸化

E.coli Poly(A)聚合酶能以不依赖于模板的方式催化由 ATP 转化成的 AMP 添加到单链 RNA 的 3’末端，形成 Poly(A)尾。也就是说，对于 circRNA 合成产物来说，只要是末端含有 3’OH 的线性 RNA 杂质均能在 Poly(A)聚合酶催化下在末端添加不同长度的 PolyA 尾巴，相反，circRNA 由于没有游离末端，无法发生多聚腺苷酸反应。凝胶电泳显示，不同多聚腺苷酸化反应时间（1h-5h）合成产物中的 circRNA 与携带较长 poly（A） 尾的线性 RNA 杂质可实现明显分离。

   

oligo(dT)亲和层析纯化 circRNA

在多聚腺苷酸反应产物中，无游离末端的 circRNA 无法发生多聚腺苷酸反应，而环化反应产物中所有的线性 RNA 末端均发生多聚腺苷酸反应，添加上不同长度的 PolyA 尾巴。需要注意的是，circRNA 内部存在 50nt 和 18nt Poly(AC) Spacer 序列，因此，也可挂在 oligo(dT)层析柱上面。然而，相比 circRNA 内部的Poly(AC) Spacer 序列，多聚腺苷酸化的PolyA尾巴较长（约超过 200nt），与 oligo(dT)层析柱亲和结合能力肯定更强。

在用水洗脱的时候，circRNA 与填料结合能力弱，首先被快速洗脱下来，形成第一个洗脱峰；线性 RNA 杂质-PolyA 尾与填料结合能力更强，被后洗脱下来，形成第二个洗脱峰。凝胶电泳显示，第一个洗脱峰单一的 circRNA 条带，而第二个洗脱峰显示多个条带，表明存在线性 RNA 杂质和少量 cirRNA 的混合物。此外，多聚腺苷酸反应时间在 1h-4h 之间添加的 PolyA 长度均可实现 circRNA 和线性 RNA 杂质的分离，

   

RNase R 和 HPLC-SEC 纯化 circRNA

RNase R 选择性地消化带有 3′-OH 末端的 RNA，保留 circRNA，但其特异性有限，并且它也可以降解环状 RNA，尽管程度较轻。为了实现最佳纯化，必须针对每种新的环状 RNA 优化消化条件。

HPLC-SEC 依据分子大小将环化产物中的不同组分分离，环状 RNA 主要集中在第 3 和第 4 个洗脱峰。在第 3 个洗脱峰组分中 circRNA 占据 50%。第 4 个洗脱峰共收集到 3 个 EP 管中，凝胶电泳显示，第一个管组分含有少量线性 RNA 杂质，第二管和第三管 circRNA 纯度很高。

比较三种 circRNA 纯化方法

circRNA 纯度和回收率

采用 HPLC-SEC 分析 PolyA 加尾/oligo(dT)亲和层析、RNase H 富集及 SEC-HPLC 纯化得到的 circRNA 纯度。RNase H 富集纯化得到的 circRNA 分离为 4 个不同的色谱峰，circRNA 纯度约为 85%。相比之下，PolyA 加尾/oligo(dT)亲和层析和 SEC-HPLC 纯化得到的 circRNA 只显示一个单峰，circRNA 纯度达到 99%。PolyA 加尾/oligo(dT)亲和层析回收率为 42%，而 SEC-HPLC 回收率为 14.6%。

circRNA 表达水平

与 SEC-HPLC 纯化得到的 circRNA 相比，无论是在细胞水平（BV-2 小胶质细胞系），还是小鼠体内，PolyA 加尾/oligo(dT)亲和层析纯化的 circRNA 翻译表达水平明显更高，表达持续时间更长。

circRNA 免疫原性

在这项工作中，研究人员使用双突变型 T7 RNA 聚合酶（T7-GAG，G47AL+L884G）进行体外转录反应，显著减少了 dsRNA 的产生。将野生型 T7 RNA 聚合酶合成的、未纯化的 circRNA 与双突变型 T7 RNA 聚合酶合成的、SEC-HPLC 或者 PolyA 加尾/oligo(dT)亲和层析纯化的 circRNA 转染 A549 细胞（LNP 作为转染试剂），使用荧光定量 PCR 检测炎症因子的表达。未纯化的 circRNA 会引发免疫因子的显著表达，而 SEC-HPLC 或者 PolyA 加尾/oligo(dT)亲和层析纯化的 circRNA 几乎不会引发免疫反应