膀胱尿路上皮癌（UCB）是一种世界上最常见的复发率高的恶性肿瘤。大约70％的患者被诊断为非肌层浸润性肿瘤（NMIBC），30％的患者被诊断为肌肉浸润性肿瘤（MIBC）。 50％的MIBC患者在肺，骨和肝器官发生转移，导致其预后不良。 目前还没有有效的治疗方法可用于发生肿瘤转移的UCB患者。 因此，更好地理解UCB肿瘤发生发展分子机制有助于开发治疗UCB的有效方法。已有大量研究报道， circRNA表达失调与多种肿瘤的发生发展相关。 然而，circRNA对于癌细胞上皮-间质转化（EMT）进展的功能和临床意义仍不清楚。
来自广州中山大学肿瘤防治中心的谢丹教授研究团队最近于CLINICAL CANCER RESEARCH（IF=10.199）发表题为“PRMT5 Circular RNA Promotes Metastasis of Urothelial Carcinoma of the Bladder through Sponging miR-30c to Induce Epithelial-Mesenchymal Transition”的研究论文。该研究发现了膀胱尿道上皮癌（UCB）患者的血浆中circPRMT5的表达水平与患者临床分期级别高和预后差成正相关。具体机制主要是circPRMT5可作为miR-30c的sponge，促进EMT进程相关的SNAIL1基因表达上调，E-cadherin基因表达下调，从而促进UCB的侵袭和迁移。而且患者的血浆和尿液外泌体中circPRMT5表达水平上调，并与肿瘤的转移相关，提示circPRMT5可作为UCB患者的预后生物标志物，也可作为治疗UCB患者的潜在靶点。
- 对UCB组织样本进行circRNA表达谱分析，并筛选和鉴定circRNAs
作者对三对UCB组织样本和其相应正常组织样本进行circRNA芯片分析，发现37种circRNAs表达上调，43种circRNAs表达下调（A）；分层聚类分析了上调水平最大的前15种和下调水平最大的前15种circRNAs（B）；其中circRNA_101320表达水平上调高达6倍以上，通过比对GRCh37/hg19基因组，发现其来源于染色体14q11.2中的PRMT5基因，故命名为circPRMT5。为明确其临床意义，RT-qPCR检测UCB组织样本，发现在UCBs样本中circPRMT5表达水平明显上调，而且相比于无发生转移样本，发生淋巴结转移的样本中circPRMT5表达水平也相对偏高（C）；进一步临床统计分析显示上调的circPRMT5水平与患者的无疾病生存期DFS呈负相关（D）。Sanger测序RT-PCR产物证明了circPRMT5是由5’端7号和6号外显子与 3’端的5号外显子连接而成（E），同时利用靶向7号和5号外显子连接序列探针、7号外显子的探针进行杂交实验，证明了circPRMT5的存在，而且不同于线性PRMT5，RNase R处理说明circPRMT5是环状RNA，可以耐受RNase R（F）。mRNA成分分离和FISH实验都证明了circPRMT5主要存在于胞浆中（G,H）。
- circPRMT5表达上调促进UCB的迁移和侵袭
在UCB细胞（T24, TCC-SUP, 5637）中，circPRMT5过表达和敲低的效果很明显，而且都不会影响其对应基因的mRNA的表达（A,B） ;体外实验证明circPRMT5过表达可以明显促进UCB 5637细胞的迁移和侵袭；而circPRMT5敲低可以明显抑制UCB 5637细胞的迁移和侵袭（C-F）；体内实验（尾静脉回输circPRMT5过表达和敲低的UCB细胞后，观察其发生肺转移的情况）证明，circPRMT5过表达的UCB细胞发生肺转移的情况更严重；而circPRMT5敲低的UCB细胞发生肺转移的情况明显减轻（G-H）。
- CircPRMT5是否可以调控UCB细胞的EMT进程？
在UCB细胞中敲低circPRMT5后，WB检测发现上皮marker—E-cadherin表达水平明显增加，而间质marker—Vimentin 和N-cadherin表达水平明显下调（A）；而在UCB细胞中过表达circPRMT5会下调E-cadherin的表达，上调Vimentin 和N-cadherin表达（B）。另外在T24细胞中敲低circPRMT5和5637细胞中过表达circPRMT5后，FISH免疫荧光杂交实验也证明了与WB同样的结果（C-D）。这些结果提示，circPRTM5可以促进UCB细胞的EMT进程，而且该过程不依赖于PRMT5 mRNA。
- circPRTM5是否可以结合miRNA?
为明确circPRMT5是否存在AGO2复合物中，通过RIP实验pull-downAGO2复合物，再RT-qPCR检测circPRMT5的表达情况，发现内源性circPRMT5会富集在RNA诱导的沉默复合体（RISC complex）中（A）。为了明确circPRTM5是否可以结合某种miRNA发挥功能，通过荧光素酶报告基因实验，首先转染circPRMT5 shRNA后，其荧光素酶活性明显降低，证明了shRNA的有效性（B）；接着利用miRNA模拟物库（83种miRNA）来筛选可以结合circPRMT5的miRNA，只有miR-30c, miR-335, miR-188, miR-377 和miR-597这五种，可以明显降低至少一半的荧光素酶活性（C）。通过TargetScan预测miRNA结合位点情况，均发现这五种miRNA至少都含有1-2个circPRMT5结合位点（D）；而如果突变了荧光素酶报告质粒上的circPRTM5的3’UTR序列后再转染miRNA，发现荧光素酶活性并无明显降低（E），提示circPRMT5可能作为这五种miRNA的sponge，调控其下游基因的表达。
为进一步明确具体是哪种miRNA结合了circPRMT5，通过biotin标记的 circPRMT5 进行RIP实验， RT-qPCR检测复合物中的miRNA，发现了只有miR-30c有明显富集情况（F）；如果敲低了circPRMT5表达后，RIP复合物中富集的miR-30c明显减少（G）；RNA-FISH实验证明了内源性或者外源性circPRMT5与miR-30c的共定位（H）。
- circPRMT5结合miR-30c后会对UCB细胞有什么影响？
- 体外实验：circPRMT5敲低可以明显抑制UCB细胞的迁移和侵袭能力，而如果同时给予miR-30c抑制剂，可以抵消UCB细胞迁移和侵袭能力被抑制的效应（A,C）; circPRMT5过表达可以明显促进UCB细胞的迁移和侵袭能力，而如果同时给予miR-30c模拟物，可以抵消促进UCB细胞迁移和侵袭能力的效应（B,D）。
②体内实验： circPRMT5敲低可以明显抑制UCB细胞发生肺转移，而如果同时给予miR-30c抑制剂，可以大部分抵消肺转移被抑制的效应（E）; circPRMT5过表达可以明显促进UCB细胞发生肺转移，而如果同时给予miR-30c模拟物，可以抵消促进肺转移的效应（F）。
③作者假设circPRMT5结合miR-30c，促进miR-30c下游靶向基因的表达，通过miRanda数据库分析，miR-30c可直接结合EMT进程相关的转录因子SNAIL1的3’ UTR区域，转染miR-30c可以明显抑制UCB细胞的SNAIL1表达。另外在UCB细胞中敲低circPRMT5表达后，WB和FISH检测发现E-cadherin表达水平明显增加，而Vimentin 和N-cadherin表达水平明显下调，而同时给予miR-30c抑制剂，会出现相反的WB和FISH结果（G,H）；过表达circPRMT5会下调E-cadherin的表达，上调Vimentin 和N-cadherin表达，如果给予miR-30c模拟物，会出现相反的WB和FISH结果（I,J）。
- circPRMT5/miR-30c/SANIL1/E-cadherin通路对于 UCB患者的临床意义
通过对收集的临床数据进行统计分析，circPRMT5与miR-30c表达水平成负相关（A）；高表达的circPRMT5与SNAIL1表达水平成正相关，而与E-cadherin的表达水平成负相关（B,C）。为明确miR-30c通路对于UCB患者的临床意义，通过TCGA数据分析，发现miR-30c表达水平与患者的OS和DFS生存期成正相关（D），而且无发生转移的UCB患者的miR-30c表达水平明显上调（E），进一步提示了miR-30c对UCB发展的抑制作用；临床数据统计和TCGA数据分析显示，miR-30c表达水平与SNAIL1表达水平成负相关，而SNAIL1表达水平与E-cadherin的表达水平成负相关（F,G）。
- circPRMT5存在UCB患者血浆和尿液外泌体中，与促进肿瘤转移有密切关系
作者对临床患者血浆和尿液外泌体进行分离后，表型鉴定外泌体后，RT-qPCR分析发现circPRMT5也富集在这些来源的外泌体中，而且其高表达水平与肿瘤淋巴结转移和分期进展成正相关，而且这些外泌体中circPRMT5和miR-30c的表达水平也是成负相关，以上结果提示UCB细胞会分泌含有高水平circPRMT5的外泌体，进入循环血液或者尿液，促进肿瘤发展和转移，也提示circPRMT5可作为UCB患者的预后生物标志物，也可作为治疗UCB患者的潜在靶点。
参考文献
- Chen X, et al. PRMT5 Circular RNA Promotes Metastasis of Urothelial Carcinoma of the Bladder through Sponging miR-30c to Induce Epithelial-Mesenchymal Transition. Clin Cancer Res. 2018 Oct 10. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-18-1270.