原发性肝癌是全球癌症相关死亡的第三大常见原因。肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝脏癌症。由于缺乏高特异性和敏感性的早期诊断生物标志物， HCC患者通常得不到及时的治疗。用于临床诊断的经典生物标志物包括α-胎蛋白（AFP），α-胎蛋白-L3（AFP-L3）和脱羧基凝血酶原（DCP）。 然而，这些生物标志物会造成一些HCC患者假阳性和假阴性的诊断结果。因此，用于HCC患者诊断的新诊断生物标志物仍然是迫切需要的。
由于大多数基于蛋白实验的诊断缺乏预期的精确性，所以考虑非编码RNA作为诊断HCC的生物标志物。据报道，长链非编码RNA——UCA1可作为用于诊断HCC的标志物，其敏感性高达90%，特异性高达82%。还有长链非编码RNA ——HULC9、DANCR10、 linc0122511和一些microRNA——如miR21被报道具有作为诊断HCC的生物标志物的潜能。相比于长链非编码RNA和miRNA，circRNA作为一种新型环状RNA，具有共价闭合环状结构，在组织和血液中高度稳定表达和存在。例如，circRNA_10720海绵吸附靶向vimentin的miRNA，促进EMT进程和促进HCC发生发展；circRNA_ 0016788海绵吸附miR-486，促进CDK4的表达，从而促进HCC肿瘤形成。本文作者也发现了一种circRNA_104075与肿瘤HCC的发生有着密切的关系，下面将解读一下作者的研究思路。
来自上海交通大学附属胸科医院于永春的研究团队于Cell Death Dis杂志在线发表了题为“circRNA_104075 stimulates YAP-dependent tumorigenesis through the regulation of HNF4a and may serve as a diagnostic marker in hepatocellular carcinoma”，介绍了在肝细胞癌HCC患者血清和组织、HCC细胞系中高表达的circRNA_104075，其表达受HNF4a调控，circRNA_104075海绵吸附靶向抑制YAP表达的miR-582-3p，促进肝癌的发生和进展，也揭示了circ_104075在诊断HCC方面具有高达96%的敏感性和98.3%的特异性，具有作为诊断HCC的生物标志物的潜能，且优于经典标志物AFP, DCP和AFP-L3。
1. circ_104075在HCC组织中高表达
作者首先对之前三个研究者发表的HCC组织circRNA芯片表达结果进行交叉和汇总分析，挖掘到三个芯片结果中都出现高表达的circRNA是circ_104075，故后续对circ_104075进一步分析。在10对HCC和癌旁正常组织、HCC细胞系中验证了circ_104075高表达的情况；相比于之前研究报道的诊断HCC的血清生物标志物DANCR, HULC, UCA1, miR-21 和 miR-223，HCC患者中circ_104075表达上调的水平偏高点。
2. HNF4a可以正向调控circ_104075的表达水平
通过过表达和敲低HCC致癌转录因子的表达后，发现HNF4a的表达与circ_104075的表达成正相关；相比于正常小鼠，HNF4a-/-小鼠肝的大小和重量明显减少，同时circ_104075的表达也明显降低；临床HCC组织分析发现HCC患者中HNF4a的表达水平也是明显上调，进一步证实了HNF4a的表达与circ_104075的表达成正相关的结论。
通过JASPAR数据库确定了HNF4a可以结合circ_104075启动子（−1409 to−1401）的位点；接着利用ChIP-qPCR捕获HNF4a沉淀复合物后，在HCC组织和HCC细胞系中都发现了HNF4a可以结合circ_104075启动子（−1482 to −1296）的位点；荧光素酶报告基因实验也证实了过表达HNF4a可以明显促进circ_104075启动子的荧光素酶活性，而敲低HNF4a表达抑制circ_104075启动子的荧光素酶活性；如果突变circ_104075启动子上HNF4a结合位点，过表达或者敲低HNF4a表达则对其荧光素酶活性无明显影响，提示HNF4a结合circ_104075启动子，正向调控其表达。
4. circ_104075促进致癌信号通路YAP表达
YAP可以被Hippo通路中的激酶——LATS磷酸化和抑制。 当YAP被其他刺激物，如O-GlcNAcylation激活时，它与LATS的结合解开，从细胞质转移到细胞核，与其依赖的转录因子，如TEAD和RUNX1相互作用。 YAP是众所周知的会促进HCC的因子，在大约62％的肝癌组织中表达上调。 YAP转基因过表达导致器官大小失调和最终发生HCC的结果。通过过表达和敲低circ_104075表达后，在两种肝癌细胞中RT-qPCR和Western blotting检测促进HCC的相关信号通路的改变，发现只有YAP与circ_104075的表达呈现正相关；临床HCC组织分析YAP的表达，也同样证实了YAP表达与circ_104075的表达成正相关的结论。
5. circ_104075可结合miR-582-3p发挥功能？
由于circRNA最常见的功能是作为ceRNA吸附miRNA，直接调控靶蛋白的表达，作者利用miRanda数据库预测了circ_104075最有可能结合的miRNA有miR-582-3p, miR-195-3p, miR-3916, miR-548u 和 miR-4744五种，接着利用circ_104075探针捕获复合物后RT-qPCR检测发现只有miR-582-3p的结合；通过构建突变形式circ_104075和miR-582-3p，荧光素酶报告基因实验证实了WT circ_104075和WT miR-582-3p的结合，WT miR-582-3p可以抑制WT、Mut1和Mut2 circ_104075的酶活性，而抑制不了Mut3 circ_104075的酶活性，提示circ_104075该结合位点的5’和3’端序列对于miR-582-3p的结合至关重要。同时Mut miR-582-3p则无法抑制circ_104075的酶活性。
6. miR-582-3p可以靶向结合YAP-3′UTR？
既然证实了circ_104075可以miR-582-3p，而circ_104075与YAP表达成正相关，那么miR-582-3p是否靶向调控YAP表达？体外WB结果证实了miR-582-3p表达与YAP表达的负相关性， 通过TargetScan预测了miR-582-3p的5’端可以结合YAP mRNA 的3′UTR的三个位点，对这三个位点进行突变后进行荧光素酶报告基因实验，发现miR-582-3p无法抑制Mut1-YAP-3′UTR，说明YAP mRNA 的3′UTR（315-321区域）对于miR-582-3p的5’端的结合很重要，后续会对该结合区域进一步研究；通过敲低circ_104075后抑制miR-582-3p，证明了miR-582-3p在circ_104075促进YAP表达过程中发挥着重要作用。
7. YAP-3′UTR的m6A修饰水平促进miR-582-3p的结合
由于m6A修饰在调节mRNA稳定性过程中发挥着重要作用，但是m6A修饰是否会影响到miRNA和mRNA的相互结合。利用m6A抗体捕获复合物后RNA-IP-qPCR检测到了P1-YAP-3′ UTR (235–419 区域)的表达上调，而该区域对于miR-582-3p的结合也很重要。YAP-3′UTR （235-419区域）中的353–357区域存在m6A motif（RRACU）——AGACU，通过突变这位点碱基后过表达进行RNA-IP-qPCR，发现只有不突变最后三个碱基ACU的YAP-3′UTR的m6A修饰水平不会降低。同时荧光素酶报告基因实验也证实了YAP-3′ UTR 353–357区域的AGACU对于miR-582-3p结合后发挥抑制功能来说是至关重要的。临床组织样本的RNA-IP-qPCR也证实了HCC患者组织的YAP-3′ UTR 353–357区域的m6A修饰水平明显降低，与HCC患者的YAP表达上调有一致性。
8. circ_104075对HCC临床诊断的意义
对不同肿瘤患者血清的circ_104075表达水平分析，表明circ_104075在HCC患者血清中高表达是具有特异性的，与HCC临床分期有一定正相关性，同时手术治疗后HCC患者血清中的circ_104075表达水平明显降低；AUC-ROC曲线分析，相比于HCC经典生物标志物DNACR, HULC, miR-223, miR-21和UCA1，血清circ_104075表达水平具有更高的敏感性和特异性，提示其可作为诊断HCC的生物标志物的临床应用潜能。
本文亮点：
1. 通过三个芯片分析结果获得HCC肿瘤高表达的circRNA_104075；
2. HCC致癌因子HNF4a可以正向调控circRNA_104075，促进HCC的发生的新机制；
3. circRNA_104075海绵吸附miR-582-3p，促进YAP的表达；
4. YAP 3′UTR 353–357区域AGACU位点的m6A修饰水平对于miR-582-3p的结合和发挥抑制YAP表达的功能是非常重要的。
参考文献
1. Zhang X, et al. circRNA_104075 stimulates YAP-dependent tumorigenesis through the regulation of HNF4a and may serve as a diagnostic marker in hepatocellular carcinoma. Cell Death Dis. 2018 Oct 25;9(11):1091. doi: 10.1038/s41419-018-1132-6.