RNA与蛋白相互作用是RNA功能研究的焦点问题之一，也是环状RNA研究者接下来经常会遇到的问题。本文将通过解读有关方法学资料介绍一种RNA-蛋白相互作用的验证实验：电泳迁移率改变（EMSA）实验。主要参考2011年发表在 Methods in Molecular Biology上的一篇方法学文章(Maxwell, 2011) 。

电泳迁移率改变实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是常用的研究核酸-蛋白相互作用的技术，基本原理是如果核酸分子与蛋白存在相互作用，电泳中会因为两者结合而导致电泳速度变慢，通过杂交实验可以看出具体的变化状态。该实验的操作相对简单，还能进行定量分析，是研究RNA-蛋白相互作用非常有用的技术。

材料与试剂：

常规材料：

重蒸酚（Tris-HCl, pH 8.0）；

氯仿：异戊醇（24:1）；

RNase-Free超纯水；

3M乙酸钠（pH 5.2）；

无水乙醇；

70%乙醇

放射标记RNA制备用试剂材料：

小牛肠磷酸酶（CIP）及10×CIP buffer：0.5 M Tris-HCl (pH 9.0), 100 mM MgCl2, 10 mM ZnCl2, 0.1 M spermidine-HCl

多核苷酸激酶（PNK）及10×PNK buffer：0.5 M Tris-HCl (pH 7.6), 70 mM MgCl2, 50 mM 二硫苏糖醇(DTT)

[γ-32P] 标记ATP

G-25 sephadex 凝胶珠与离心柱 (Amersham Pharmacia)

TE buffer：10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA.

丙烯酰胺母液：acrylamide：bisacrylamide=19:1

10×TBE：0.89 M Tris base, 0.89 M 硼酸, 20 mM EDTA

尿素（分子生物学级）

10% 过硫酸铵(APS)：现用现配

TEMED

Gel loading buffer: 80%甲酰胺, 1×TBE, 10 mM EDTA

溴酚蓝和二甲苯蓝染料

Clear plastic wrap (SaranTM wrap)

Black India ink

RNA洗脱缓冲液：0.3 M乙酸钠, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.1% SDS

磷屏或X-胶片

0.45-μm孔径的针头滤器

EMSA试剂：

Buffer D: 20 mM HEPES (pH 7.0), 0.1 M NaCl, 3 mM MgCl2, 0.4 mM EDTA, 1 mM DTT, 20% 甘油

10×binding buffer：0.1 M HEPES, pH 7.0, 1 M NaCl

10×phosphate dye: 25 mM 磷酸钾 (pH 7.0), 25%蔗糖, 0.1 mg/mL 溴酚蓝

10×phosphate buffer: 0.25 M 磷酸钾 (pH 7.0)

甘油（分子生物学级）

3mm厚度Whatman滤纸

实验方法：

RNase-Free技术要求：

  1. 玻璃器皿通过高温消毒方法实现RNase-Free，DEPC处理塑料制品；
  2. 实验全程带手套，避免皮肤来源的RNase污染；
  3. 避免重复使用枪头；
  4. 保持操作台面整洁无尘，移液枪等设备定期清洗；
  5. 所有试剂保证无RNase污染；
  6. RNA样品操作要格外小心，尽量低温操作。避免RNA样品接触二价离子，高pH值（>9.0）或长时间高温放置。

酚-氯仿提取RNA：

  1. 向样品中加入等体积的苯酚（注意事项1），剧烈震荡混匀；
  2. 10000×g 离心 3 min上层水相转移至新的RNase Free的EP管中（注意事项2）；
  3. 重新向苯酚中加入等体积的RNase-Free水混匀后离心收集水相；
  4. 向两次收集的水相中加入等体积的氯仿，剧烈震荡混匀，10000×g 离心 3 min；
  5. 上层水相转移至新的离心管中，加入1/10体积的3 M 乙酸钠（pH 5.2），加入预冷的无水乙醇至终体积比浓度为70%，–20℃ 放置大于 1 h（注意事项3）；
  6. 室温>10000×g 离心20 min ，小心去除上清；
  7. 用等体积的预冷70%乙醇洗涤沉淀，轻轻颠倒混匀数次，立即室温>10000×g 离心20 min ，小心去除上清；
  8. 冻干法或阴凉处晾干，沉淀用RNase-Free水溶解，测量浓度，保存备用（注意事项4）。

放射标记RNA制备：

常见的放射标记的RNA分为全标记和末端标记两种方式。本方法主要介绍末端标记的探针制备与分离纯化的方法（注意事项5）。

  1. 探针分子去磷酸基：

在1.5mL的RNase-Free EP管中按下列体积配制反应体系：

RNA探针 20μg

10×CIP buffer 20μL

CIP (1U/μL) 10μL

ddH2O 补充至总体积为200μL

37℃孵育45min。酚-氯仿法纯化RNA样品。沉淀用30μL RNase-Free水溶解，测量浓度，保存备用。

  1. 探针末端标记：

在1.5mL的RNase-Free EP管中安下列体积配制反应体系：

CIP-treated RNA (1–2μg) 50–80 pmol

10×PNK buffer 2.5μL

[γ-32P] ATP (1μCi/μL) 8–10μL

PNK (20 U/μL) 1μL

ddH2O 补充至总体积为25μL

  1. 37℃孵育1.5h。添加25 μLddH2O，酚-氯仿法纯化RNA样品。沉淀用30μL RNase-Free水溶解，测量浓度，保存备用。

为有效去除未准确标记至探针分子中游离[γ-32P] ATP，需要进行探针纯化。探针纯化的方案有两种：酚-氯仿抽提结合分子筛纯化的方法；基于凝胶纯化的方法。凝胶纯化法能获得更高纯度的探针样品。

酚-氯仿抽提结合分子筛纯化：

  1. 将待纯化的探针体系加至2-cm bed of G-25 分子筛凝胶柱(Amersham Pharmacia)上（注意事项6），<1,000×g离心3 min；
  2. 用闪烁计数器检查Cerenkov计数的放射性（注意事项7）。注意不要使用闪烁液。将1μL的洗脱液放入闪烁小瓶中的0.5mL微量离心管中进行计数。
  3. 标记好日期和放射性计数并将纯化后的探针储存在-20ºC。 注意32P的半衰期为14.2天。

凝胶纯化法纯化：凝胶纯化法能获得纯度更高的探针，尤其是存在样品降解的情况。

  1. 准备40mL 6% 丙烯酰胺溶液 (丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=19:1)，1×TBE 和7 M 尿素溶液（注意事项8）；
  2. 加入10% APS (8μL/mL) 和TEMED (1μL/mL)，颠倒混匀，灌胶，室温聚合20min；
  3. 用1×TBE冲洗并预电泳20min，电流控制在40–45 mA（注意事项9）；
  4. 向待纯化探针体系中加入Loading Buffer，样品煮沸3-5min，室温冷却后上样电泳，电流控制在40–45 mA，电泳时间大约1-2h；
  5. 将电泳胶板撬开后用塑料膜覆盖暴露的一侧，用混有放射性染料（1μL[γ-32P] ATP）的30μL黑色印度油墨标记凝胶的三个角，风干凝胶；
  6. 用干净的胶带盖住干燥的墨滴，并在上面放上一个phosphorimager卡带。暴露5-10分钟（注意事项10）。在phosphorimager中扫描磁带，并在玻璃板下面打印出凝胶。对齐点并用热处理的剃须刀片切出放射性RNA带；
  7. 用1mL的Tip头将凝胶片捣碎，加入500μL的RNA洗脱缓冲液，室温下摇动45分钟（注意事项11）；
  8. 10000×g离心2分钟回收洗脱的RNA。通过0.45μm注射器过滤器将洗脱液（凝胶头顶部的溶液）过滤到新的1.5 mL EP管中；
  9. 用300μL的RNA洗脱缓冲液重复洗脱。再次混匀并通过相同的注射器过滤以与之前的洗脱液合并。将洗脱液分成两个管（每个400μL）和乙醇沉淀物（不添加乙酸钠）。

表1 不同浓度凝胶分离效果 （来自(Maxwell, 2011)）

EMSA实验检测RNA-蛋白相互作用：

RNA结合蛋白结合反应体系：

  1. 按下图的体系配制反应体系：

表2 RNA结合蛋白结合反应体系 （来自(Maxwell, 2011)）

将10×binding buffer与tRNA加水混匀（注意事项12）；

加入sR8 RNA（注意事项13）；

加入Buffer D 和L7Ae 蛋白（注意事项14）。

  1. 轻轻混匀体系，70℃反应8分钟（注意事项15）。自然冷却至室温，离心弃沉淀，上清转移至新的离心管中，加入2μL 10×phosphate dye，轻轻混匀。

Native非变形电泳胶制备：

  1. 准备40mL 6% 丙烯酰胺溶液 (丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=19:1)，1×phosphate buffer和2%甘油（注意事项16）；
  2. 加入10% APS (8μL/mL) 和TEMED (1μL/mL)，颠倒混匀，灌胶 (尺寸16×18×1.5 cm)，插入15孔梳子（注意事项17），室温聚合20min；安装玻璃板，加入1×phosphate buffer作为电泳液（注意事项18）；

RNA-蛋白复合物电泳分离：

  1. 尽量采用冷循环电泳液的体系进行电泳（注意事项19），尽量降低电泳体系的发热造成的影响，（文中建议的是Hoefer SE600）；
  2. 150V电泳，约1.5~2h，溴酚蓝电泳至凝胶2/3位置。0

电泳结果成像：

  1. 分开玻璃板，使凝胶粘在一块板上；
  2. 将两片比凝胶略大的3mm Whatman滤纸切下。 将滤纸压在凝胶上。 从纸上剥下纸（注意事项20）。 凝胶将粘在纸上；
  3. 用透明塑料膜包住凝胶的暴露面，并在80℃的真空下在凝胶干燥器中干燥1小时。
  4. 干燥时，丢弃滤纸背面（吸收多余的液体和放射性物质）。将凝胶暴露于phosphorimager盒过夜或X射线胶片2-4小时。

注意事项：

  1. 使用苯酚时要特别注意。理想的情况下，苯酚应该重新蒸馏。使用前在0.1M Tris-HCl缓冲液中平衡（pH8.0）。添加0.2％的β-巯基乙醇可防止氧化并延长保质期。在-20℃存储重蒸和平衡苯酚，4℃储存短期内用的。-20℃放置6月后或者如果变色（最常见的是粉红色），则应丢弃。
  2. 酚和水层有可能会变成相反的分层，例如使用非常高盐或蔗糖浓度的溶液。在提取之前或之后加入少量的水区分哪一层是含水的。小心不要收集含水相的苯酚。为了获得最佳结果，将一些水相留在苯酚顶部以确保不收集苯酚。 如果用水相收集苯酚，则将其在氯仿萃取步骤中除去。 在RNA沉淀过程中，苯酚/氯仿提取的最后一步中所携带的氯仿除去。
  3. 非常稀的RNA溶液通常不会完全沉淀。在这里介绍的方法一般不会出现这个问题。 但是，如果出现了，可在-20℃孵育过夜（16小时）提高沉淀效率。此外，可以添加少量的辅助剂来帮助沉淀，例如糖原或后期反应中安全的非特异性RNA（经常使用来自大肠杆菌或酵母的tRNA）。
  4. 使用比尔定律从260nm处的吸光度（如果消光系数是已知的）计算RNA浓度，或者将在260nm处的OD值乘以40μg/ OD / mL的一般转换因子来计算RNA。 这可得到以μg/ mL为单位的RNA浓度值。
  5. 如果所使用的RNA是合成的，那么它没有5’磷酸，这一步应该省略。 如果RNA在体外转录或从提取物中纯化，则需要去磷酸化。
  6. 使用前，G-25树脂应在TE缓冲液中溶胀并平衡。摆动式转子将提供更清洁的分离和更有效的去除游离[γ-32P] ATP。
  7. 切伦科夫计数不要使用闪烁液。将1μL洗脱液放入闪烁小瓶中的0.5mL微量离心管中进行计数。
  8. 对于特定RNA，可以根据要分辨的RNA的大小选择凝胶百分比（参见表1）。 我们在实验室中用1×TBE，7M尿素保存20％丙烯酰胺的原液，并用1×TBE，7M尿素的原液稀释，得到所需的最终丙烯酰胺百分比。 这样可减少每次新鲜的准备工作，这是不必要的和耗时的。室温下避光保存，1个月后丢弃。
  9. 凝胶预电泳是必要的，能提高凝胶的温度，手触感觉非常温暖或稍微有点热的比较理想。凝胶中的热量和尿素有助于保持RNA变性。一般而言，电泳RNA直到其通过凝胶的方式移动大约2/3（参见表1）。电泳过程需要注意避免凝胶过热。在电泳过程中，玻璃板应该是温热的，但不要发烫，如果板子太热有可能会开裂。 如果最终的电泳结果呈现出“微笑”样，中间比外部样品跑得快，则表明凝胶加热不均匀。 应该通过减少通过凝胶的电流来避免太多“微笑”样的带型。
  10. 尽量不要调整phosphorimager图片的大小，如果有必要可调整对比，然后打印。也可将凝胶在暗房里用X光胶片曝光5-15分钟，显影后的胶片可以放在玻璃胶板的下面。
  11. 此处的洗脱步骤可以在4℃摇动过夜完成。
  12. L7Ae的储存和稀释缓冲液是缓冲液D。要直接将蛋白质溶液直接加入反应中，而不是直接加到反应管的两侧。
  13. 在这些反应中，tRNA在超过摩尔浓度时用作非特异性RNA。其存在确保只观察到特定的RNA结合，并在凝胶上提供更好的RNP分辨率。
  14. 放射性标记的RNA应与非放射性标记的RNA混合，制成每立方厘米20,000 cpm和0.2 pmol RNA的储备液。每次反应20,000cpm一般而言是足够的，但也可以优化显影条件。
  15. M. jannaschii是L7Ae蛋白与sR8 box的高亲和力高效结合C/D sRNA需要高温。 大多数RNA结合蛋白最佳结合的范围从4到37℃。常常加入过量的非特异性蛋白如牛血清白蛋白（BSA）以保持蛋白质水平处于相对恒定的浓度，防止蛋白质沉淀，并提供更清楚的RNP解析。由于在用于结合的极端热条件下可能发生的聚集和沉淀，BSA不在这些反应中添加。 最终反应物含有20mM HEPES，pH 7.0, 0.15M NaCl，0.5mM DTT，0.2mM EDTA，10％甘油，1.5mM MgCl2，1mg / mL tRNA。
  16. 甘油是凝胶的重要组成部分，不要忽略。在成像显影之前干燥凝胶期间，甘油防止凝胶收缩和破裂，这可能使凝胶不能用于出版。 甘油也被认为有助于RNP的解决。
  17. 在灌胶之前应彻底清洗玻璃板，并保持不含有清洁剂。玻璃板可以在组装之前用乙醇擦拭或冲洗以除去灰尘。玻璃板也可以烘烤，虽然彻底的清洗往往足以去除污染的RNA酶。
  18. 1×phosphate buffer对真菌和细菌生长敏感，应在使用前从10×储备液中新鲜制备。 如果在电泳期间或之后在顶部和底部之间重新循环，运行缓冲液可重复使用多次，但最好每次现配现用。
  19. 点样时要小心，尽量避免将样品与电泳缓冲液混合。首先将点样器的头插到点样孔的底部，然后慢慢点样。当快要加完的时候先把Tip头提起，慢慢取走。避免从Tip头吹出气泡以避免样品被带出或稀释。Native凝胶不具有压缩的效果，因此点样的过程要尽量使样品紧，这对形成清晰的条带非常重要。凝胶必须保持冷却以获得最佳分辨率。冷水自来水通常是足够的。不要让凝胶的温度升高超过室温几度。
  20. 如果凝胶浓度较高（> 14％），凝胶可能不会粘在滤纸上。 在这种情况下，将保鲜膜置于凝胶上，翻转凝胶并铺平，然后将凝胶剥离。 凝胶应粘在保鲜膜上。 然后可以将滤纸放在凝胶的顶部以进行干燥。 对于低浓度凝胶（4％），凝胶可能非常容易变形，使得凝胶带在干燥和显影之后波状起伏。 将凝胶从平板转移到滤纸时要小心。 如果凝胶不会粘附在一块板上，那么将ddH2O喷到凝胶上会有所帮助。

参考文献：

Maxwell, K.T.G.a.E.S. (2011). Electrophoretic Mobility Shift Assay for Characterizing RNA–Protein Interaction. Methods in molecular biology.

 

分类： circRNA-蛋白互作, 最新重要进展评论

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