细胞培养基本方法

细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养主要应用于以下三个方面：

1. 药物研究与开发

• 新药筛选
• 疫苗研究与开发
• 基因工程药物研究与开发
• 细胞工程药物研究与开发

2. 基础研究

• 药物作用机理
• 基因功能
• 疾病发生机理

3. 生物制药

• 疫苗生产
• 基因工程药物生产
• 诊断用和药用单克隆抗体生产
• 细胞工程药物生产

培养细胞的生长方式：

贴壁生长：

必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体组织来源细胞、上皮细胞，如下面左图。

悬浮生长：

于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞，如下面右图。

细胞培养的环境：

1、温度环境：37℃。偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强。

2、气体环境： 95%空气加5%二氧化碳

3、酸度环境：大多数细胞的适宜PH 为7.2-7.4，细胞耐酸性比耐碱性大一些。

4、 细胞培养基：合成培养基、天然培养基。

5、细胞培养的仪器与设备：CO₂培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养瓶、培养皿、液氮罐、无菌水、PBS、培养基、胰蛋白酶液等。

6、无污染环境：微生物污染一直是细胞培养的主要问题，严格遵守无菌操作技术。

原代培养：细胞分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段。

传代培养：培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。

传代培养的要诀

1.勤观察

• 每天肉眼观察培养基颜色是否异常，有无混浊
• 观察培养基颜色变化速度是否异常：变化过慢意味着细胞生长过于缓慢；变化过快而细胞密度并不大，表明有污染的可能性。
• 镜下观察细胞形态、生长速度。
• 观察培养箱水盘中的水是否干净。
• 观察CO₂压力表。
• 观察液氮罐内液氮体积

2.严格无菌操作

轻柔：避免机械力损伤细胞，重悬细胞时尽量用50ml离心管，通过晃动离心管分散细胞，尽量避免过力吹打。离心力不可超过300g（普通台式离心机水平转子1000rpm）。

快速：防止因过分小心导致操作时间过长，增加污染概率。

何时换液？

• pH降低。培养基颜色由红变橙要警惕，变成黄色之前一定要换液。pH降至6.5时，细胞停止生长；降至6.0，细胞失去活性。无法挽救。
• 发现细胞出现形态衰退时须勤换液
• 若培养物密度过低或者生长缓慢，则更换一半培养基。

贴壁细胞换液的操作：吸出或倒出旧培养基；加入同体积新培养基。

悬浮细胞换液操作：将培养液移入离心管中，1000rpm×5min 离心，弃上清，加入新培养基重悬细胞，移入培养瓶，继续培养。

每代贴附生长细胞的生长过程：

• 游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时
• 贴壁期：血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）
• 潜伏期：此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。
• 对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
• 停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。 机制：接触抑制、密度抑制。尽量避免细胞进入平台期。

何时传代？

在对数生长末期传代，不可在潜伏期传代。

贴壁细胞何时传代？

• 细胞密度，90％汇合度。若继续放置超过24h，细胞将脱离细胞周期，再接种需要很长时间才能恢复。
• 须频繁更换培养基时。
• 理想的传代频率：1:2～1:4传代，接种密度10⁴～10⁵/ml， 每7天传代一次。
• 常规传代最好依据严格的时间表进行。

贴壁生长细胞传代方法

• 吸尽培养瓶中的培养液。
• 用PBS（或Hank’s）洗涤细胞两次，吸光缓冲液。
• 加入0.25％的胰蛋白酶液（0.1ml/cm²）到培养瓶细胞面对侧。
• 翻转培养瓶，使胰酶完全覆盖细胞层，静置2-10 min（室温或37度，显微镜下动态监测，至细胞变圆隆起）。
• 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入含血清培养基以终止消化反应。
• 用吸管吸取瓶内培养基，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。
• 收集细胞悬液于离心管内，1000rpm×5min离心，弃上清。
• 加入培养基重悬细胞。
• 吸取适量细胞悬液，接种于新的培养瓶内。
• 加适量新鲜培养基于接种了细胞悬液的新培养瓶内。
• 将新培养瓶放入培养箱中培养。

悬浮细胞传代

• 细胞密度：超过1×10⁶/ml，需要频繁更换培养基时。
• 离心法传代：离心（1000rpm×5min）去上清，沉淀物加新培养液后混匀传代。

细胞计数

• 制备单细胞悬液，吹打均匀后，转移一小部分样本（500ul）至1.5mlEP管中，加入等体积0.4％台盼蓝染液。
• 75％酒精清洗计数板表面，注意不要划伤计数表面。
• 将已染色待测细胞悬液吹打均匀，然后用移液器吸取20ul细胞悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，液体刚好流到计数板凹槽边缘。注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
• 将计数板平放在显微镜载物台上计数。
• 统计角上四个大格的活细胞数。对于压线细胞的处理：数上不数下，数左不数右细胞团按照一个细胞计。结果计算：（细胞悬液的细胞数）/ml＝ （ 四个大格子细胞数之和/4) ×10⁴×2

细胞计数板 深度1mm，每个大方格是0.1mm³

细胞冻存

• 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。
• 细胞冻存和复苏过程中，对细胞最大伤害的是细胞内水形成的冰晶。所以最重要的就是要减少冰晶的形成。

1. 冻存和复苏的原则：慢冻快融

• 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
• 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

2. 加入细胞保护剂（DMSO、甘油等）

常用的低温保护剂是二甲基亚砜（DMSO），它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。有毒！强渗透性。可以渗入乳胶手套。

• 使用浓度：5％～10％，一般用10％。
• 复苏时需1:20稀释，从10％稀释到0.5％。
• 如果进出细胞速度过快，会对细胞产生渗透性损伤。所以冻存和复苏时要尽量降低细胞内外DMSO的浓度差。
• DMSO与细胞混合后室温下不能放置超过30分钟
• 溶于水时放热，对细胞损害大。不能将纯DMSO直接加入细胞悬液。
• 少数细胞系对DMSO敏感，冻存时改用甘油。

满足冻存标准的细胞

• 形态学健康
• 生长良好
• 处于对数生长晚期
• 无污染。
• 细胞浓度至少1×10⁶/ml，最好1×10⁷/ml。
• 溶液成分：40％血清＋5%~10％DMSO＋50％合成培养基。血清含量越高，对细胞保护越好。含量最高可提高到90％。

冷冻方法一

• 先将冻存管放入4℃冰箱，约30min
• 接着置于-20℃冰箱，约30-60min
• 置于-80 ℃超低温冰箱中放置过夜
• 置于液氮罐中长期保存
• —20 ℃放置时间不可过长，否则细胞存活率低。可略去这一步，4 ℃30min后直接放入-80 ℃超低温冰箱

程序降温盒

冷冻方法二

• 将冻存管放于程序降温盒中。
• 将程序降温盒置于－80 ℃超低温冰箱中放置过夜。
• 置于液氮罐中长期保存。

细胞复苏的方法

• 从液氮中取出冷冻管，迅速放入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右），

水面不可没过盖子，防止水污染细胞。注意，冻存管可能爆炸！

• 培养液稀释至原体积的20倍。滴加，10ml/2分钟，先慢后快，边加边摇晃培养瓶。防止DMSO渗透性损伤。

细胞的运送

冻存细胞用干冰运输，鲜活细胞要灌满培养基。

细胞库推荐

1.American Type Culture Collection(ATCC) https://www.atcc.org/

2.中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库http://www.cellbank.org.cn/

3.中科院昆明细胞库 http://www.ctcccas.ac.cn/

4.中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心) http://sub.whu.edu.cn/cctcc/