广大circRNA研究者同行在针对感兴趣的circRNA进行表达量分析的时候一定觉得可选择的实验方法比较有限，大规模筛选一般基于高通量测序和芯片，特定circRNA的检测基于定量RT-PCR或者微滴式数字PCR，偶尔试试Northern Blot。现在有了新的选择了，Nature子刊Laboratory Investigation （新开的杂志，还没有影响因子，主要发表一些技术类文章）在线发布了一项circRNA的定量分析技术：基于NanoString nCounter 荧光条形码标记检测技术实现circRNA绝对定量分析[1]。
什么是NanoString技术？原理是什么？
NanoString nCounter 荧光条形码标记检测技术对于大部分人可能还是比较陌生的，这个技术是美国NanoString公司的专利技术，曾经在2008年发表了Nature Biotechnology文章[2]，感兴趣的读者可以去看看。
NanoString nCounter 荧光条形码标记检测技术的原理概括起来就是：针对靶分子设计两个探针：捕获探针和报告探针，捕获探针带生物素标记，报告探针带四色荧光基团，可通过不同的排列组合方式实现标记。检测过程中将总RNA与两种探针杂交，纯化，固定后扫描后得到表达量的结果。从测试的结果来看，该技术的定量效果和检测灵敏度要好于传统的芯片法，与Real-Time PCR相似。
图1 NanoString nCounter技术原理 （来自[2]）
NanoString nCounter技术使用的两种探针长度在35-50nt， 设备经条件优化后一次性可检测800个分子。由于必须捕获探针和报告探针均能杂交的分子才能被检测到，因此大大提高了检测的特异性和灵敏度，也有一定的检测通量，是核酸分子绝对定量分析的有益补充。
怎样利用NanoString技术进行circRNA的定量？
回到今天给大家介绍的这篇文章，本文作者选择B细胞恶性肿瘤作为实验材料，基于RNA-seq结果针对52种circRNA设计了NanoString nCounter检测探针体系（覆盖了反向拼接位点前后100nt的范围），尝试了基于该技术进行circRNA绝对定量分析。在高质量RNA，低质量RNA中提取的RNA等样品中对NanoString nCounter检测结果与RNA-seq和RT-QPCR检测结果进行比较，表明NanoString nCounter检测结果要比RNA-seq的结果稳定，可重复性好。
首先基于RNA-seq分析了五种B细胞恶性肿瘤的circRNA表达情况，挑选了每个junction point位点Reads数大于5的列出来：
图2 RNA-seq检测细胞中circRNA表达 （来自[1]）
其中有多种circRNA的表达明显高于对应的线性RNA的（circular to linear ratio, CTL ratio），具体的也列出了下表：
图3 CTL较高的circRNA （来自[1]）
针对几个circRNA也进行了RT-PCR和Sanger测序鉴定，也做了RNase R消化前后的Northern鉴定：
图4 相关circRNA鉴定（来自[1]）
为验证NanoString nCounter检测对不同质量的RNA检测的效果，作者除了在培养细胞中检测，还选取了冰冻细胞样品，石蜡包埋细胞样品，组织样品等进行了验证，各种RNA样品的质检结果：
图5 各种样品质检结果 （来自[1]）
NanoString nCounter检测高质量和低质量RNA的检测结果分析如下：
图6 NanoString nCounter检测适用于不同RNA质量的样品 （来自[1]）
RNase R消化后验证检测的准确性，结果表明在各种RNA质量的样品中，NanoString nCounter检测能准确的定量circRNA。
图7 NanoString nCounter检测适用于不同RNA质量的样品 （来自[1]）
对NanoString nCounter检测的52种circRNA的表达量结果做成热图如下：
图8 NanoString nCounter检测结果 （来自[1]）
本文首次报道基于NanoString nCounter检测对circRNA进行绝对定量，该技术灵敏度较高，稳定性好，而且具有一定的通量，对circRNA的检测非常有用。
参考文献
1. Mette Dahl, I.D., Maria Schertz Andersen, Thomas Birkballe Hansen, Kirsten Grønbæk, Jørgen Kjems, Lasse Sommer Kristensen, Enzyme-free digital counting of endogenous circular RNA molecules in B-cell malignancies. Laboratory Investigation, 2018.
2. Geiss, G.K., et al., Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat Biotechnol, 2008. 26(3): p. 317-25.