1月13日，Molecular Therapy: Nucleic Acids（影响因子6.39）在线发表了北京大学药学院汤新景教授课题组的最新文章，报道发现将干扰RNA的一条设计为闭合环状的形态将有助于提高特异性和延长作用能力，降低脱靶效应(Liangliang Zhang 2018)。这一研究报道预示着未来circRNA或许可以直接成为有效的核酸药物！
脱靶效应一直是干扰RNA有效发挥作用的最大问题之一，本文独辟蹊径，尝试直接将siRNA的一条链设计成环状的形式，另一条链仍为线性（circ-siRNA），预实验结果表明这种形式的siRNA不仅可以有效降低靶mRNA，还能实现链特异性的干扰效果。体内实验也表明circ-siRNA的作用时间更持久。作者是怎么设计和验证circ-siRNA的作用的？下面就让我们一起学习一下：
为什么设计成circ-siRNA 形式？
为了提高siRNA的作用，很多科学家曾设计出非常多的奇特分子形式。如下图所示， “改良版”的设计包括一条链两端均加长的不对称siRNA，一对二的sisiRNA，已经广泛使用的发夹RNA，直接将两条链设计到同一个circRNA闭环分子的哑铃型RNA以及各种在siRNA的末端添加化学修饰以稳定siRNA分子的尝试。本文作者尝试了将一条链设计为circRNA形式。另一条链仍为线性RNA的环状干扰RNA（circ-siRNA）。
图1 不同形式的“改良版”siRNA设计 （来自(Liangliang Zhang 2018)）
这种circ-siRNA是如何合成和鉴定的？作者的方案是按照常规的化学合成法其中的一条链，用T4连接酶将其5’和3’端连接到一起。将另一条链通过高温退火的方法互补匹配上去，就形成了circ-siRNA分子。环化与否的单链分子可以通过非变性胶电泳分辨出来。
图2 非变性胶分离环化与否的单链RNA分子（来自(Liangliang Zhang 2018)）
c-GS：环化的靶向GFP的正义链单链；c-GAS：环化的靶向GFP的反义链单链；GS：非环化的靶向GFP的正义链单链；GAS：非环化的靶向GFP的正义链单链。
Circ-siRNA的作用效果如何？
为了分析作者提出的circ-siRNA的效果，作者分别设计了靶向GFP的环形和线性RNA单链，然后进行组合，分析它们的干扰效果。在稳定性方面，靶向GFP的circ-siRNA（c-GAS/GS）比传统的siRNA（GAS/GS）更抵抗RNase A的消化作用。
图3 circ-siRNA更耐受RNase消化 （来自(Liangliang Zhang 2018)）
各种线性和环形单链RNA的组合分析度靶基因的干扰效果，结果表明正义链为circRNA，反义链为liner RNA形式的组合效果最佳。
图4 正义链为circRNA的circ-siRNA的干扰效果最佳 （来自(Liangliang Zhang 2018)）
除了正反链的组合，作者也分析了RNA的长度对效果的影响，选择用荧光素酶进行分析。结果表明正义链为21个碱基，反义链为24个碱基的组合效果较好。
图5 长度对circ-siRNA的干扰效果的影响 （来自(Liangliang Zhang 2018)）
为分析circ-siRNA的脱靶效应，作者设计了在荧光素酶报告基因的上游添加正义链和反义链的靶序列，看不同组合对链选择性的影响。结果表明，正义链为21个碱基的环形RNA，反义链为24个碱基的线性RNA的组合形式能够有效的选择性靶向特定序列，而对互补链的作用非常微弱，显示了很强的链特异性干扰效果。
图6 circ-siRNA具有链特异性的干扰效果 （来自(Liangliang Zhang 2018)）
Circ-siRNA在体内的作用效果如何？
上述实验表明在细胞模型中，正义链为21个碱基的环形RNA，反义链为24个碱基的线性RNA的组合形式不仅能有效干扰靶分子，还能有链选择性的特征。传统的siRNA双链很难实现只针对一条链特异性起作用，而对反义链没有作用。本文的circ-siRNA则具有这一特性。那么这种设计方案在体内效果怎样呢？作者构建了GFP表达的U87细胞进行分析，结果表明circ-siRNA的作用更持久。
图7 circ-siRNA在体内的作用更持久（来自(Liangliang Zhang 2018)）
本文的工作非常有意义，提供了全新的干扰RNA设计思路，尤其是针对同时存在正义链和反义链转录产物的问题，传统的siRNA方案存在对另一种分子形式的脱靶作用，而正义链为21个碱基的环形RNA，反义链为24个碱基的线性RNA的siRNA分子形式则可以实现链特异性的干扰作用。为未来开发有效的基于circ-siRNA的核酸药物设计提供了全新的思路。
参考文献：
Liangliang Zhang, D. L., Changmai Chen, Yuan Wang, Gubu Amu, Jiali Yang, Lijia Yu, Ivan J. Dmochowski, and Xinjing Tang (2018). “Circular siRNAs for Reducing Off-Target Effects and Enhancing Long-Term Gene Silencing in Cells and Mice.” Molecular Therapy: Nucleic Acids.