转录组测序（RNA-Seq）是目前应用最为广泛的一种测序方法之一，可以为科研小伙伴们提供整个转录本的信息，可以研究基因的差异表达，确定基因或转录本结构，检测转录本的结构变异，识别可变剪切，发现非编码RNA（non-coding RNA）等。
在选择转录组测序服务时，不少小伙伴们常常纠结是选择链特异性转录组测序还是非链特异性转录组测序，两者到底有什么区别？链特异又有何优势？我们这就来揭一揭“链特异”的神秘面纱。
什么是链特异性转录组测序？
普通的转录组测序文库是无法保留转录本的方向信息的，得到数据的小伙伴们不知道手上序列到底是来自于基因本身还是它的反向互补序列，而很多基因区域都存在着正反义链的转录本，尤其是大多数非编码RNA都来自反义链。链特异性转录组测序是指在文库构建过程中将RNA链的方向信息保存到测序文库中，测序后的数据分析可以确定转录本是来自正义链还是反义链。
那这个过程又是如何实现的呢？
链特异测序文库构建方法
目前最为常用的链特异文库构建方法是dUTP二链法，如下图所示。
通过Poly A捕获或去除了rRNA之后的RNA，片段化后用随机引物逆转录合成cDNA第一链，在合成第二链时用dUTP替代dTTP，接头连接后用UDG酶将合成的第二链降解，只留下两端带有不同序列接头的cDNA第一链进入后续的PCR扩增环节，扩增出来的文库就保留了RNA的方向性。
细心的小伙伴也许会发现，链特异性文库除了在二链合成时与普通转录组文库有所不同之外，在一链合成时也会多加入一个试剂——放线菌素D（Actinomycin D），它能抑制聚合酶在合成cDNA一链的过程中同时合成cDNA二链。下图为N*公司对是否添加放线菌素D的对比实验结果。从图中可以看到，90%以上的reads都比对到了预期的正义链上，说明测序文库的链特异性良好。
链特异性测序的优势应用
1 获得更准确的基因表达定量
链特异性测序保留了RNA链的方向信息，能够降低read ambiguity的比例，解决在正义链和反义链带有overlap的编码基因，由于其反向转录本带来的reads数而使表达量虚高的问题，使基因表达定量更为准确。
2提高发掘circRNA的准确率
链特异性文库可以排除反义转录本的影响，可以更精确地检测可变剪切，降低可变剪切事件识别的假阳性。circRNA由反向剪切形成，链特异性的测序方式有助于提高circRNA检测的准确率。
3识别非编码反义转录本
目前研究发现大多数lncRNA都转录自反义链，链特异性测序可以检测非编码反义转录本，确定那些位于基因间的非编码转录本的方向，这是普通转录组测序无法实现的。
4更好地预测新转录本
在预测新的转录本时，明确转录本的方向性很有必要，在进行转录组组装时如不能区分正反链，那么有互补配对关系的编码与非编码转录本就会被组装成一条转录本。
5 原核生物操纵子分析
原核生物的基因多是多顺反子的结构，链特异性测序能够更准确地对操纵子进行分析与鉴定。
参考文献：
1. Strand-specific libraries for high throughput RNA sequencing (RNA-Seq) prepared without poly(A) selection
Zhao Zhang1, William E Theurkauf2, Zhiping Weng3 and Phillip D Zamore1*
2. Comparison of stranded and non-stranded RNA-seq transcriptome profiling and investigation of gene overlap
Shanrong Zhao1*, Ying Zhang2, William Gordon2, Jie Quan3, Hualin Xi3, Sarah Du2, David von Schack2* and Baohong Zhang1*
3. Strand-Specific RNA-Seq Provides Greater Resolution of Transcriptome Profiling
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4. Comprehensive comparative analysis of strand-specific RNA sequencing methods
Joshua Z. Levin1,6, Moran Yassour1,2,3,6, Xian Adiconis1, Chad Nusbaum1, Dawn Anne Thompson1, Nir Friedman3,4, Andreas Gnirke1, and Aviv Regev1,2,5 1Broad
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