Several Questions about NGS（For Illumina platform）
Q1:血清/血浆及其外泌体样本是否可以进行circRNA测序？
A1:可以。血清/血浆及其外泌体样本中的RNA片段化程度较高，大小在200nt以上的RNA含量少，浓度低，且样本采集过程及保存条件对RNA质量影响较大。因此，最好选用2mL以上半年内收集的无反复冻融的血清/血浆样本。
Q2:建库测序之前常用Agilent 2100生物分析仪对RNA样本进行质检，其结果如何看？
A2:一看RNA完整性： RNA质检峰图可以直观地反映出RNA的完整性，类似琼脂糖凝胶电泳图，但其灵敏度更高；同时报告中会提供28s/18s 核糖体RNA的比值和RIN值（RNA Integrity Number）。RIN值是对RNA完整性、纯度或降解程度的数字化评估，一般RIN值大于7时，认为RNA完整性较好，满足后续建库测序要求。
二看RNA浓度：RNA质检时会根据峰图积分面积计算出所测样本RNA的浓度，可与其他浓度检测仪器（如Qubit或Nanodrop）所测浓度进行对比，如两者数值相差较大，可考虑是否存在基因组DNA污染等。
Q3:常规的细胞或组织样本与血清/血浆、外泌体、FFPE等特殊样本在做全转录组测序时数据质量是否有不同？
A3:会有不同。常规细胞或组织样本抽提出来的RNA质量较高，建库起始量足够，测序数据质量较好，一般有效数据mapping率85%以上；而血清/血浆、外泌体、FFPE等特殊样本RNA降解程度较高，浓度低，建库起始量不足，测序数据质量较差，一般有效数据mapping率50%左右。
Q4:核酸片段化的方法是什么？
A4:在构建二代测序文库时，通常要将样本DNA或RNA进行片段化。DNA片段化的方法主要有酶学方法和物理方法。常用的DNA片段化酶有转座酶（如Tn5）和非特异的核酸内切酶（如NEB的NEBNext dsDNA Fragmentase）。DNA片段化的物理方法主要是超声剪切，比较常用的仪器有Covaris和Bioruptor。RNA片段化常用的方法是在高温条件下利用金属阳离子（如Mg2+，Zn2+）作用一定时间。其片段化程度与缓冲液的PH值、阳离子的浓度、反应温度及时间有关。
Q5: 分选文库插入片段大小的方法及原理是什么？
A5: 目前所采用的分选文库目的片段的方法为磁珠法。它是一种基于固相载体可逆化固定（SPRI）的分离纯化方法。磁珠体系中一般包含：磁珠、DNA、聚乙二醇（PEG）以及盐离子等。DNA在一定浓度的PEG存在条件下，NaCl或MgCl2促进条件下，使DNA发生脱水反应，分子构象会发生急剧变化，由线状被压缩形成卷曲球状，继而聚集沉淀。通过加入不同比例的磁珠，形成不同浓度的PEG及盐离子缓冲溶液，使不同长度的DNA片段可以被选择性的沉淀出来。
Q6: 为什么常规全转录组测序要先去除rRNA？
A6：核糖体RNA的遗传信息的保守性较高，在不同组织、器官中也十分稳定，研究者更倾向于研究信息含量更为丰富的mRNA、非编码RNA以及circRNA等。在抽提所得的总RNA中，80%以上都是核糖体RNA，如采用Oligo dT磁珠捕获mRNA则会丢失不含polyA尾的lincRNA、circRNA等。因此，采用去除rRNA的建库方式能最大程度地保留转录组RNA信息，提高测序有效数据量。
Q7:全转录组测序与circRNA测序有什么不同？
A7:全转录组测序采用去rRNA链特异性的建库方式，数据分析内容包含了mRNA、lncRNA及circRNA全部信息，数据质量较好。CircRNA测序采用去rRNA去线性链特异性的建库方式，通过RNase R 消化线性RNA从而富集circRNA，对建库起始量要求较高（一般大于2μg），测序数据质量较全转录组稍差，但可将circular junction reads数提高10倍以上，更适合专注circRNA研究的项目。
Q8：文库构建中的“Index”、“Adapter ” 和 “Primer”有何异同？
A8：“Index”即标签序列，用以在建库测序中区分不同的样品，也称之为“Barcode”。常用的index一般为6碱基或8碱基，可选择在文库单端或双端插入。
“Adapter”指的是二代测序文库构建时所用的接头，其作用是使DNA或cDNA片段带上可用于后续上机测序的特定序列（具体序列与选择的测序平台有关，这里指的Illumina测序平台），一般分为universal adapter（如NEB的U型接头）和complete adapter（如Illumina的Y型接头）两种。两者的区别是后者带有完整的上机测序所需的序列信息，且带有不同的Index序列。
“Primer”即引物，在二代测序文库构建中主要指的是文库扩增时所用的引物，也分为两种，一种与universal adapter配套使用，上游引物为通用引物，下游引物带有不同的Index；另一种与complete adapter配套使用，上下游均为通用引物，一般混为“Primer Mix”使用。
Q9: 二代测序中，Illumina测序平台要怎么选择?
A9:一般测序平台是根据文库的插入长度及其数据量需求进行选择。Illumina常用的测序平台有Miseq，Hiseq2500、HiSeq Xten和Novaseq6000。Miseq系列的测序模式有PE250和PE300，读长分别为500和600个碱基，16s文库一般都选择这两种模式。Hiseq2500常用的模式为SR50和PE250，SR50读长为50个碱基，small RNA测序一般选择这种模式；PE250读长为500个碱基，16s文库或插入较长的文库会选用该模式。HiSeq Xten和Novaseq6000常用模式为PE150，其读长为300个碱基，大部分的RNA文库和DNA文库均采用该模式进行测序。
Q10:测序数据需求量有xM reads数和数据量xG base两种表示方法，这两者的区别是什么？
A10:高通量测序平台经过桥式PCR产生的cluster数量就称为reads数，如small RNA文库产生的数据量是10M reads，意为该文库在测序过程中产生了1千万条reads。数据量data表示的是测序所得的碱基总数，如circRNA文库产生数据量为10G，意为该文库在测序过程中读取了100亿个碱基的信息。Reads数和数据量data是可以进行转换的，reads数与测序读长的乘积即为数据量data。如文库在PE150模式测序产生了30M的reads数，则其数据量约为9G base。