图片摘要：Molecular Therapy-Nucleic Acid杂志报道，线粒体编码的circRNA mc-COX2在慢性淋巴细胞白血病中具有促癌作用。
4月28日，Cell子刊Molecular Therapy: Nucleic Acid杂志在线发表了一项线粒体circRNA的功能研究，报道发现线粒体基因组编码的circRNA mc-COX2在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中高表达，可以促进细胞增殖，促进凋亡抵抗。干扰mc-COX2可协同促进抗肿瘤药物的作用（[1]）。本文首次报道了线粒体来源的circRNA在血液肿瘤中具有促癌作用。文章的通讯作者是南京医科大学附属第一医院李建勇主任和金晖博士。该项研究由李建勇教授团队与吉赛生物合作完成。
环状RNA（circRNA）是一种新型的非编码RNA，它在癌症的发生和进展过程中起着非常重要的作用。目前的研究绝大部分集中在核基因组产生的（nu）-circRNA，对线粒体基因组产生的（mt）-circRNA的生物学作用和临床特征仍然未知。在这项研究中，作者发现并鉴定了一种在慢性淋巴细胞白血病（CLL)患者血浆中高度表达的mt-circRNA ：mc-COX2，来源于CLL细胞并由外泌体递送，其表达水平与CLL的进展和预后相关。
图1 CLL中mc-COX2作用机制 （[1]）
mt-circRNA在CLL患者的血浆和细胞中高表达
circRNA与多种疾病有关，并在肿瘤发生发展中起到重要作用。然而，人们对circRNA在血液疾病尤其是CLL中的功能了解甚少。为了揭示circRNA在CLL中的表达谱，作者收集了5位初诊未治的CLL患者和5位年龄/性别匹配的健康捐助者（HD）的血浆样品，用于circRNA芯片分析。结果显示，在CLL血浆中有51个circRNA表达显著变化（倍数≥2，p <0.05）。令人惊讶的是，在28种上调的circRNA中，排名前4位的circRNA均为mt-circRNA。其中选取hsa_circ_0089762（mc-COX2）进行验证和进一步研究。通过Northern Blot证实了mc-COX2是环状RNA，RNA-FISH结果表明mc-COX2主要分布于细胞质中。
图2 mc-COX2在CLL患者血浆及细胞中检测及鉴定（[1]）
大量的mc-COX2富集在外泌体中并可以作为CLL患者的预后指标
由于CLL血浆中mc-COX2的表达显著增高，作者进一步研究其生物学作用和临床特征。首先，从54例初诊未治的CLL患者和40例HD中收集血浆样本进行qPCR，以评估mc-COX2的临床价值。如预期，与HD相比，CLL患者中mc-COX2的表达明显增加。根据血浆中mc-COX2的表达水平，将CLL患者分为高表达组和低表达组。Kaplan-Meier分析显示，高表达组的CLL患者总生存率（OS）明显较低，提示mc-COX2可以作为CLL患者的预后指标，它的高表达伴随着较差的预后。
有证据表明circRNA可以在外泌体中富集，从而使circRNA进入血液循环并在血浆中检测到。作者推测CLL患者血浆中特异性高表达的mc-COX2可能来源于肿瘤细胞并由外泌体运输。为此，作者收集了20名CLL患者和20名HD的血浆样本并分离出血浆外泌体。然后通过共聚焦电子显微镜对这些囊泡进行观察。通过流式细胞仪和Western blot检测到外泌体标志物CD63、CD81和TSG101的存在，证实了该血浆外泌体的纯度。qRT-PCR的结果表明，与正常对照相比，CLL血浆外泌体富含mc-COX2。这些结果表示mc-COX2在外泌体中含量丰富，外泌体可以把mc-COX2从CLL细胞传递到血浆中。
图3 mc-COX2在血浆外泌体中富集并可以作为CLL患者的预后指标 （[1]）
mc-COX2的特征
使用特异性跨剪接位点的引物进行反转录PCR扩增mc-COX2，产物进行测序，验证了mc-COX2在MEC-1（CLL细胞系）和HEK-293T（人类胚胎肾细胞系）中存在。用RNase R和放线菌素D来验证mc-COX2的稳定性，作者首次发现并证实了mc-COX2的稳定性比ciRS-7（已被报道的一种nu-circRNA）和circRPL15（已被报道的在CLL血浆中高表达的nu-circRNA）低，但比线性RNA稳定得多。
已知RNA结合蛋白（RBP）参与circRNA的生成过程。由于线粒体基因组中存在大量RBP结合位点，探索RBP是否可以调节mt-circRNA的生成。通过circInteractome预测分析出与4个高表达mt-circRNA相关性最高的RBP：AGO1、AGO2和FMRP。在MEC-1中，使用siRNA分别敲低AGO2、AGO1和FMRP，发现mc-COX2表达没有显著变化，该结果提示mt-circRNA的生成或许不受到相关RBP的调控。
由于circRNA被广泛证明具有内源竞争RNA（ceRNA）的功能，因此作者评估了mt-circRNA作为microRNA（miRNA）海绵的潜力。使用AGO2抗体进行IP分析，以检测circRNA与AGO2蛋白的结合能力。与ciRS-7不同，mc-COX2无法被AGO2抗体富集中。因此，作者推测mc-COX2乃至其他mt-circRNA有可能通过不同于nu-circRNA的特殊机制发挥调控作用。
图4 mc-COX2的特征 （[1]）
mc-COX2可以影响线粒体功能并促进CLL细胞增殖
鉴于mc-COX2源自线粒体基因组，作者进一步探索了mc-COX2表达是否可以调节线粒体功能。使用JC-1荧光探针分析线粒体膜电位，发现mc-COX2的敲低降低了RFP / GFP的比例。此外，通过ATP测定法检测mc-COX2对ATP水平的调节，抑制mc-COX2后，ATP的产量显着下降。之后，探索mc-COX2在细胞生长中的作用，通过CCK-8实验和细胞计数检测了CLL细胞系（MEC-1，JVM-3）和CLL患者的原代细胞（CLL-1）的增殖能力，结果显示mc-COX2的敲低明显抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。对CLL患者原代细胞中凋亡细胞的百分比进行了定量，验证了相同的结果。这些结果表明，mc-COX2对CLL细胞的线粒体功能、细胞的增殖和凋亡起到一定的调控作用。
图5 mc-COX2调节线粒体功能和CLL细胞增殖 （[1]）
线粒体相关化合物和抑制剂可以降低mc-COX 2水平与协同mc-COX 2抑制CLL细胞增殖
据报道，与正常的B淋巴细胞相比，CLL细胞的线粒体生成数量增加。为了探索mc-COX2表达是否取决于线粒体的数量和活性，作者使用不同浓度的羰基氰-3-氯苯腙（CCCP）、强力霉素或二甲双胍处理CLL细胞系，观察到mc-COX2在不同时间点显着下调。CCCP可导致线粒体衰竭和细胞凋亡。强力霉素可抑制线粒体活性和细胞生长。二甲双胍是一种有效的线粒体呼吸链抑制剂，可降低不同类型癌症的发生率、进程和死亡率。它们都可以抑制细胞增殖，而敲低mc-COX2可增强这种抑制作用。
图6 线粒体相关化合物对CLL细胞的作用 （[1]）
为了进一步研究线粒体对mc-COX2的影响，作者选择了四种与线粒体相关的小分子抑制剂（Daporinad、PI-103、OSI-027和ABT-199）研究发现，四种抑制剂均可以抑制CLL细胞中mc-COX2的表达和细胞增殖，此外，mc-COX2的敲低会进一步增强四种抑制剂对CLL细胞增殖的抑制作用。其中，OSI-027的抗白血病活性显示出剂量依赖性，低剂量处理即可完全抑制细胞生长，且该抑制剂并未在CLL中有相关研究及报道，作者首次发现了其在CLL中的潜在抗肿瘤作用。这些数据表明线粒体的损伤和数量均影响mc-COX2的生成。更重要的是，在线粒体抑制剂处理后6小时，mc-COX2的减少就已经很明显，这可能与mc-COX2半衰期短有关，也提示mc-COX2的表达与线粒体功能密切相关。此外，mc-COX2的敲低对线粒体相关化合物和抑制剂的抗白血病作用起到协同促进作用。因此，mc-COX2可以作为补充靶标，来增强药物疗效和/或降低药物剂量以提高药物敏感性。
图7 线粒体相关小分子抑制剂对CLL细胞的作用 （[1]）
参考文献
1. Zijuan Wu, Handong Sun, Chunling Wang, Wenjie Liu, Ming Liu, Yanhui Zhu, Wei Xu, Hui Jin, Jianyong Li, Mitochondrial genome-derived circRNA mc-COX2 functions as an oncogene in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy: Nucleic Acid, 2020.
李建勇教授介绍
教授、主任医师、
博士生导师、博士后合作导师
南京医科大学第一附属医院（江苏省人民医院）血液科主任
南京医科大学血液研究重点实验室主任
中国抗癌协会血液肿瘤分会名誉主任委员
CSCO中国淋巴瘤联盟副主席
中国医师协会整合血液病学专业委员会副主任委员
中国医药教育协会造血干细胞移植及细胞治疗专业委员会副主任委员
中国慢性淋巴细胞白血病工作组组长
中华医学会血液学分会白血病·淋巴瘤学组 副组长
中华医学会肿瘤学分会淋巴瘤学组 副组长
江苏省医学会血液学分会前任主任委员
江苏省老年医学会血液学分会主任委员
南京医学会血液学分会主任委员
中国免疫学会血液免疫分会常委