图片摘要：m6A修饰可调控circRNA的生成和翻译，本文在circZNF609上进行了验证分析。
近期不断有circRNA m6A修饰相关的研究报道。5月12日，Cell Reports在线发表了一项研究，系统分析了m6A修饰对circZNF609的生成和翻译调控的机制（[1]）。文章的通讯作者是意大利罗马萨皮恩扎大学的Irene Bozzoni教授。Irene Bozzoni教授主要研究非编码RNA的功能和机制，此前曾报道发现circZNF609可以以不依赖帽子的方式翻译（推荐阅读：Cell子刊连续两篇环状RNA翻译蛋白文章发表！），也曾分析了circZNF609在横纹肌肉瘤中的作用，报道了FUS介导运动神经元circRNA 表达（推荐阅读：运动神经元中FUS介导环状RNA形成）。
敲低METTL3影响circRNA的m6A修饰和表达
基于meRIP-QPCR检测，作者发现Hela细胞中circZNF609和对应线性lin-ZNF609均携带了m6A修饰。METTL3是主要的介导RNA m6A修饰的Writer，敲低METTL3后，作者发现意外的发现circZNF609的表达下降了，而lin-ZNF609及转录前体pre-ZNF609均升高。这似乎暗示m6A修饰可以介导转录产物的去向，是生成circRNA还是加工成mRNA。那么这个现象是ZNF609基因特异的，还是普遍存在的？作者通过高通量测序分析了敲低METTL3前后Hela细胞的转录组，发现circRNA和mRNA的表达均有变化，其中下调的circRNA有442种，上调226种，也有一些mRNA表达值发生了变化。那么这些有变化的circRNA所对应的mRNA是否也有变化呢？统计发现只有18.6%的circRNA所对应的mRNA也存在变化。这些测序数据分析表明，大部分的circRNA 表达变化不与母基因同步，可能存在特异性的机制。
图1敲低METTL3影响circRNA的m6A修饰和表达 （[1]）
YTHDC1调控circRNA反向剪切
YTHDC1是核内m6A Reader的一种，之前曾报道它与RNA可变剪切有关。YTHDC1是否与circRNA的生成有关呢？为探索这个问题，作者设计分析敲低YTHDC1对circRNA的影响。结果表明，敲低YTHDC1后circZNF609下降，lin-ZNF609不变，而pre-ZNF609升高。高通量测序分析结果显示，敲低YTHDC1显著改变了一些circRNA和mRNA的表达状态。Anti-YTHDC1 RIP测序表明，78%的circRNA能被显著富集2倍以上，但它们所对应的线性RNA没有这么显著的差异。敲低YTHDC1后测序结果，有482种circRNA下调，278种上调。为方便分析，作者把敲低METTL3和YTHDC1后测序的结果中下调的circRNA分为三组：只在敲低METTL3下调的（227种），只在敲低YTHDC1下调的（247种），敲低METTL3和YTHDC1均下调的（45种）。通过与meRIP，Anti-YTHDC1 RIP测序结果对比，发现敲低METTL3和YTHDC1均下调的circRNA被m6A-RIP富集的程度显著高于其他组。最后作者挑选了几个circRNA分子验证了敲低YTHDC1或METTL3前后的变化情况，与测序的结果基本一致。
图2 YTHDC1调控circRNA反向剪切 （[1]）
受METTL3/YTHDC1调控表达的circRNA有特殊的m6A修饰
上面的结果显示，有一些circRNA的生成是受到METTL3/YTHDC1调控的，那么这些circRNA外显子的m6A修饰是否有不一样的地方呢？m6A CLIP数据能更准确的定位m6A修饰位点，实验中input的RNA可以是PolyA(+)-RNA，也可以是总RNA，并且可以通过分离胞质和核组份进一步分类。为获得circRNA的m6A修饰位点信息，作者采用比较总RNA和PolyA(+)-RNA的m6A CLIP数据，那些存在于总RNA中，但不在PolyA(+)-RNA的m6A CLIP数据信息（total-only m6As），可以理解为circRNA特异性的m6A修饰信息。分析表明，敲低METTL3和YTHDC1均下调的circRNA所携带的total-only m6As的比例显著高于其他组，胞质和核内均呈现出这一趋势。以ZNF609的第二外显子为例，这个外显子形成了circZNF609，m6A CLIP数据显示，扣除了PolyA(+)-RNA的m6A位点（位点2,3）后，circZNF609有三个total-only m6As（位点α，β，γ），胞质和核内的基本一致。
图3受METTL3/YTHDC1调控表达的circRNA有特殊的m6A修饰 （[1]）
特殊m6A修饰调控circANF609的生成
上述结果表明，一些circRNA特有的m6A位点与circRNA的生成可能有关系，为分析具体的机制，作者基于过表达载体进行了分析。该载体的侧翼序列与基因组中的侧翼内含子不同。鉴定实验表明，这个过表达载体可以有效表达circZNF609，产物也可携带m6A修饰，敲低METTL3和YTHDC1均可影响这一载体的表达效率。为分析不同m6A修饰位点对m6A修饰生成效率的影响，作者将上述的PolyA(+)-RNA m6A位点（位点2,3），circZNF609特有的total-only m6As（位点α，β）以及阴性对照位点1分别构建了突变体，分析突变对对应产物表达效率的影响情况。结果显示，突变1,2,3位点不影响circRNA和前体RNA的生成效率，仅突变α，β位点也不能影响，但如果同时将位点2 与α，β一起突变，circZNF609生成显著受到抑制，转录前体RNA增多，与细胞中敲低YTHDC1的现象吻合。进一步，作者设计了不成环的载体作为对照，中间的序列与上述载体一致，这种不成环的载体中单独突变位点2或与α，β一起突变均不能影响RNA的表达。能成环的载体不突变的时候，敲低YTHDC1可降低成环产物表达，但位点2或与α，β一起突变后这种降低效应消失。
图4特殊m6A修饰位点调控circANF609的生成 （[1]）
m6A修饰调控circZNF609翻译
已知m6A修饰可以介导circRNA的翻译起始，在circZNF609中，这些m6A修饰位点是否也可以有这个作用呢？基于上述的载体设计，作者构建了Flag融合的in-frame的过表达载体，然后分别针对几个位点进行突变，比较突变前后蛋白翻译产物的影响。结果表明，位点2或与α，β一起突变能显著抑制蛋白产物的翻译，但对应的线性RNA转录产物表达没有受到影响。分别敲低YTHDF1-3，看circZNF609翻译产物的变化，表明YTHDF3与circZNF609的翻译有关，过表达YTHDF3能促进circZNF609的翻译。如果对应的序列以线性RNA进行表达，则没有这个现象。此前报道eIF4G2与m6A修饰介导circRNA翻译起始有关，作者也分别分析了敲低或过表达eIF4G2后circZNF609翻译的情况，表明eIF4G2参与调控了circZNF609的翻译。YTHDF3和eIF4G2的RIP实验证实了两种蛋白均可与circZNF609结合。
图5 m6A修饰调控circZNF609翻译 （[1]）
本文的工作主要分析了circZNF609中m6A修饰对其生成效率和翻译的作用，高通量测序分析敲低METTL3，YTHDC1的表达谱结果表明体内存在一类circRNA与circZNF609一样，可以通过METTL3/YTHDC1途径调控表达，并且大部分circRNA的表达与母基因mRNA的表达没有必然关系。
参考文献：
1. Di Timoteo, G., et al., Modulation of circRNA Metabolism by m(6)A Modification. Cell Rep, 2020. 31(6): p. 107641.