RNA作为一种重要的生物大分子，主要通过与其他分子的相互作用发挥功能，包括与其它RNA分子，蛋白或者DNA的相互作用。CircRNA是一种新型的非编码RNA，也是最近RNA领域的研究热点之一，其表达具有呈现一定的组织和疾病特异性。与传统的线性RNA不同，大多数circRNA是由外显子的3’和5‘端反向剪接而形成稳定的环状结构。目前circRNA的研究主要集中在circRNA与miRNA、circRNA与蛋白相互作用的方向。明确与circRNA发生相互作用的分子对于circRNA下游功能和机制研究至关重要。鉴定circRNA与RNA、蛋白相互作用的研究方法，包括FISH，luciferase reporter，RIP和RNA pull-down等。（PS：其中研究RNA-蛋白相互作用的综述之前3月9号在公众号发表过，有兴趣的参考一下）
其中RNA pull-down作为检测RNA与其结合蛋白相互作用的一种重要的手段，已广泛应用于circRNA与miRNA或蛋白相互作用的研究。RNA pull-down技术的基本原理是利用化学标记的探针或RNA分子的自带标签捕获靶分子及其相互作用分子，进一步通过分离后鉴定靶分子的相互作用分子。circRNA主要由常规的线性RNA外显子反向拼接形成环状的分子，它们与对应的线性RNA主要差别在接口位置，其他位置的序列几乎完全一致，因此circRNA的pull-down实验难度非常大，如何避免对应的线性RNA所带来的非特异性信号是个挑战。
化学标记探针法进行circRNA pull-down能够捕获内源circRNA分子及其相互作用分子，但适合设计探针的序列仅限于接口位置，这极大程度限制了该方法的适用范围，也不利于排除对应线性RNA所带来的非特异性信号，更无法捕捉接口位置相互作用的分子，因此化学标记探针法在circRNA pull-down实验中有很大的局限性。RNA标签则可以比较有效的解决化学标记探针法的这些不足。RNA标签是一种特殊的RNA短序列，它们能够形成特有的二级结构，有对应的结合蛋白或结合条件，目前比较成熟的RNA标签（如MS2，BoxB等等）都是来源于远源物种，在哺乳动物体系，包括人源体系中具有较低的内源性干扰因素，因此可以具有非常高的特异性。将RNA标签引入待分析的circRNA分子序列中，类似于蛋白序列中常用的Flag标签，能够大大提高circRNA分子结合条件的特异性，因此在circRNA pull-down实验中有独特的优势。
目前也有一些RNA标签法用于circRNA pull-down 的相关文献报道，下面我们就以2016年的一篇Nature Communication文章为例，介绍该方法如何有效的解决circRNA与蛋白相互作用的问题：
这篇发表在Nature Communication上的题为“Circular non-coding RNA ANRIL modulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans”研究，通讯作者是来自德国慕尼黑大学的研究人员。研究发现，来自染色体9p21心血管疾病基因座转录形成circANRIL可结合PES1（前rRNA 60S组装的必要因子），影响血管平滑肌细胞和巨噬细胞中核酸外切酶介导的前rRNA加工和核糖体的生物形成，导致核仁应激和后续的p53通路的激活，继而促进细胞凋亡和抑制细胞增殖，增强抗动脉粥样硬化的效应。该研究为治疗和诊断动脉粥样硬化提供了潜在的治疗靶点【1】。
circANRIL主要的亚型是由5,6,7号外显子组成的。circANRIL在健康或者发病的心血管组织中均有表达，同时也在原代平滑肌细胞SMC和单核巨噬细胞中表达。染色体9p21来源的circANRIL具有抗动脉粥样硬化的作用，与之前报道的linANRIL促动脉粥样硬化的结果相反。过表达circANRIL，显著性地促进细胞凋亡，而抑制细胞增殖；当利用siRNA敲低circANRIL表达，则抑制细胞凋亡，而促进细胞增殖。过表达circANRIL并不影响肿瘤抑制基因CDKN2A/B的表达，也不影响linANRIL的表达水平。另一方面，虽然经生信分析预测circANRIL与miR-4659a/b, miR-3184-3p 和 miR-5571-5p这三种存在结合位点，但表达circANRIL并没有影响这三种miRNAs的表达，这提示circANRIL可能通过全新的分子机制，而不依赖于9p21基因座的顺式调节作用和miRNA海绵作用发挥其生理功能。
由于linANRIL曾被报道具有结合蛋白的能力，作者尝试circRNA pull-down进行蛋白组筛选鉴定circANRIL可能结合的蛋白。通过在HEK293中过表达含有发夹RNA BoxB序列标签的circANRIL（BoxB序列不影响circANRIL的环化结构），利用λN-peptide与发夹RNA BoxB序列的高亲和力，用结合λN-peptide的磁珠，可直接捕获与circANRIL结合的蛋白后，进行质谱分析蛋白组。RT-qPCR证明RNA pulldown产物中富集circANRIL，该方法特异而有效。质谱分析结果显示存在32种结合蛋白，主要富集的蛋白参与核糖体的生物合成、组装和RNA剪切的调节等生理过程。qPCR-RIP实验和circRNA pull-down后WB实验证实了circANRIL结合 PES1，而不是NOP14。由于PES1对PeBoW复合物功能至关重要，抑制该复合物会导致不成熟rRNA亚型的累积。过表达circANRIL会造成前rRNA 36S 和32S的明显累积，造成核仁应激反应（核仁变得更多和更小），促进P53在核仁中的聚集和被激活。
小结：作者在发现circcANRIL不依赖于9p21基因座的顺式调节作用和miRNA海绵作用发挥其生理功能后，采用circRNA pull-down后MS技术，鉴定与circANRIL结合的蛋白，这也是本文的一大亮点，通过该技术挖掘了circRNA发挥功能的新机制，发现pull-down富集的蛋白主要与核糖体的生物形成、组装和RNA剪切的调控有关，这才最终聚焦到主要结合蛋白PES1。PES1是PES1–BOP1–WDR12 (PeBoW)复合物的主要成分，该复合物参与核糖体大60S亚单位的生物形成。circANRIL可结合PES1，影响SMC和巨噬细胞中核酸外切酶介导的前rRNA加工和核糖体的生物形成，则导致核内前rRNA累积，核仁应激的发生和p53基因的激活，继而促进细胞凋亡和抑制细胞增殖。
参考文献
- Holdt LM, Stahringer A, Sass K, et al. Circular non-coding RNA ANRIL modulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans. Nat Commun. 2016 Aug 19;7:12429. doi: 10.1038/ncomms12429.