前两天我们解读了曹雪涛院士5月18日在Hepatology杂志在线发表的研究论文，其中用到了一种专门钓取目标环形RNA竞争性结合的miRNA的技术，称为circRNAS IN VIVO PRECIPITATION (circRIP) [1]，山人根据曹院士所引用的他们之前发表的文章，找到了该实验技术的详细资料，下面一起跟大家分享学习一下：
1. circRIP实验主要流程
miRNA Sponge模型是报道最多的环形RNA的功能模型，但大部分的文献报道都只停留在生物信息学预测的水平，实验验证的相对少很多，山人以为，主要是验证实验的技术选择有限，实验难度偏大等原因所致。但随着环形RNA研究的不断推进，仅仅通过信息学的预测已不能满足同行审议的要求了，还需要补充相关的实验证据，circRIP实验就是一种比较有效的实验技术。
circRIP技术在曹院士早期的文章中称为明天miRIP实验[2]，主要是为钓取目标RNA分子在细胞内所结合的内源性miRNA进行的一种RNA沉淀分析技术。概括而言，这一技术是通过在培养细胞中转染带标记的探针分子，然后通过甲醛交联将探针和靶标RNA分子及有相互作用的miRNA分子通过磁珠富集，再利用定量PCR或芯片分析等技术对有结合的miRNA分子进行筛选和鉴定[2]。如果探针是特异性针对目标环形RNA的，该技术就可称为circRIP了。
图1 miRIP技术流程（来自[2]）
2. 需要准备的试剂和Buffer配方
裂解液： 20 mM Tris-HCl（pH 8.0）, 500 mM NaCl，2.5 mM MgCl2， 2% SDS，RNase抑制剂（Superase-In，Ambion），蛋白酶抑制剂 (Roche)
洗脱液A：10 mM Tris-HCl（pH 8.0），1 M NaCl，40 mM EDTA，RNase抑制剂和蛋白酶抑制剂。
洗脱液B：10 mM Tris-HCl（pH 8.0），150 mM NaCl，40 mM EDTA，1% SDS，RNase抑制剂和蛋白酶抑制剂。
上述溶液中RNase抑制剂和蛋白酶抑制剂必须现配现加，具体浓度参考说明书。
3. circRIP实验流程
细胞培养与探针转染：细胞接种至10cm培养皿中，培养48h，细胞保持在对数生长期为佳。避免过满。生物素标记的探针和非特异性空白对照探针按200 nM浓度转染，37℃, 5% CO2培养条件。
磁珠准备：将带链霉亲和素标记的磁珠（M-280，Invitogen）充分混匀后按100µL/份分装至1.5mL EP管中，先用溶液Ａ（0.1 M NaOH＋0.05 M NaCl）洗涤两次，再用溶液Ｂ（0.1 M NaCl）洗一次。为避免磁珠与蛋白和RNA的非特异性结合，需要用RNase-free 的BSA 和酵母tRNA（均购自Ambion）进行包被。100µL的磁珠悬液分别用10 µLBSA (10 mg/ml) 和 10 µL tRNA (10 mg/ml)进行包被，室温充分颠倒混匀3小时。最后用500µL裂解液洗涤两次，再用1000µL裂解液重悬，备用。
样品制备：收取转染探针24小时后的细胞，首先用1%甲醛固定细胞10分钟，甘氨酸溶液平衡处理5分钟以终止甲醛固定反应，预冷PBS洗三次，用1mL裂解液刮取细胞并静置10分钟，超声处理样品（VCX130, SONICS & MATERIALS，处理的参数条件如下：50% 振幅，持续脉冲30s，停顿30S如此反复10min），10000g离心10分钟，上清转移至2mL离心管中，取50µL保存，作为input对照。
磁珠结合：所获得上清与预处理的磁珠混合，颠倒混匀1小时，使探针与磁珠充分结合。分别用洗脱液A和B洗涤两次，用200µL裂解液重悬，放置2小时进行解交联，以释放样品中被甲醛交联固定的RNA分子，用于后续分析实验。环形RNA的实验磁珠结合时间可延长为过夜结合。解交联过程也可添加蛋白酶K。
RNA制备：向磁珠样品中添加300µL TRIZOL试剂（Sigma），混匀10秒钟（2-3次），放置5分钟，加入100µL氯仿，剧烈震荡30S，12000 g ，4℃离心15 min，上清转移至新的EP管中（RNase-Free），用1µL DNAmate (TaKaRa)沉淀RNA样品+ 36 µL 3 M NaCl+ 360 µL 异丙醇 在-80℃ 沉淀至少1小时以上， 12000 g，4℃离心30分钟。弃上清，沉淀用500µL 70% RNase-free水配制的乙醇洗涤，小心弃乙醇，室温晾干后用50µL RNase-free水重悬，备用。如用DNase I处理RNA样品，处理完成后重新用TRIZOL试剂进行提取RNA操作。
所得RNA样品可进行miRNA的定量PCR分析或芯片分析等下一步的鉴定和分析工作。
4. circRIP实验可能需要注意的细节
该技术体系基于细胞内交联，能保持内源性RNA结合和互作的信息，是比较有效的分析miRNA与线性RNA（包括mRNA和lncRNA等）以及环形RNA的相互作用，对于验证miRNA Sponge模型非常有用。用此技术进行环形RNA特异性结合的miRNA鉴定和分析需要注意以下几点：
（1）探针特异性需要经过预实验验证。与所对应的线性RNA相比，环形RNA的最大差别位点在环化位点周围，为找到环形RNA特异性结合的miRNA，所使用的探针的特异性必须进行预实验验证。大部分环形RNA的表达量与所对应的线性RNA接近或略少些，但如果内源的环形RNA的表达量明显高于所对应的线性RNA，则可暂不考虑该问题。
（2）有效的实验对照设计非常关键。与蛋白相互作用分析中常用的免疫共沉淀类似，circRIP实验同样需要设计严谨的实验对照以排除非特异性结合造成的假阳性信号。
除了实验技术的细节问题，山人还想到了两个深层次的重要科学和技术的问题：
1） 环化位点周围结合的miRNA如何鉴定分析？如果所设计的探针是基于环化位点周围而设计的，探针孵育后则可能将环化位点周围的结合miRNA排除在外了，最终的结果中很可能会造成这部分区域竞争性结合miRNA信息的丢失。山人想到的一个解决办法是加标签，通过在远离环化位点的不同位点增加RNA标签，然后基于标签纯化的方法找出在环化位点周围结合的miRNA，避免造成假阴性的信号，错失重要信息。
2）环形RNA拓扑结构的影响如何排除？与线性RNA不同，环形RNA因为不存在游离末端，就必然存在拓扑结构的问题。环形RNA的拓扑结构问题目前几乎还没有受到学术界的关注，没有好用的研究技术也是一个重要原因。但不难理解的是，没有螺旋结构的环形RNA和有高度螺旋结构的环形RNA结合其他分子的能力肯定会有所差别，这方面的问题如何分析，如何解决？这还是一个悬而未决的问题，非常值得思考。
总之，circRIP技术是一种基于内源性信息的分析RNA分子相互作用技术体系，非常有助于分析竞争性结合miRNA等功能模型，值得在环形RNA功能研究中推广。
参考文献：
1. Han, D., et al., Circular RNA MTO1 acts as the sponge of miR-9 to suppress hepatocellular carcinoma progression. Hepatology, 2017.
2. Su, X., et al., An In Vivo Method to Identify microRNA Targets Not Predicted by Computation Algorithms: p21 Targeting by miR-92a in Cancer. Cancer Res, 2015. 75(14): p. 2875-85.