人乳头瘤病毒（HPV）是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形双链DNA病毒。HPV生活在皮肤表面（阴道，肛门，外阴，子宫颈和阴茎头部的表面）上皮细胞的薄而扁平的细胞中，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。许多人被感染后没有任何症状，感染可能会自行消失。HPV病毒包括有100多种亚型，高风险HPV毒株包括HPV16和18，其引起约70％的宫颈癌，其他高危HPV病毒毒株包括31,33,45,52,58等。低风险的HPV毒株，如HPV 6和11，引起约90％的生殖器疣，很少发展成癌症。通过性行为（阴道，肛门或口服）和皮肤接触传播而感染HPV 。
我们对高危HPV如何从潜伏性感染发展为无法治愈的癌症的机制认识尚不清楚，最近的研究也揭示了EB病毒和卡波西肉瘤病毒(KSHV)可产生多种环状RNA，这些病毒来源的circRNA的功能尚不清楚。
基于前面提出的问题，这次与各位分享的是一篇发表在Nature communications期刊的有关高风险HPV亚型来源的circE7翻译成E7蛋白促进子宫颈癌细胞发生转化的研究。文章的通讯作者是来自美国德克萨斯大学西南医学中心皮肤科的Richard C. Wang和芝加哥西北大学Feinberg医学院微生物免疫学系的Laimonis Laimins。
首先作者挑选了10种HPV亚型在NCBI上检索获得来自SRA的相应HPV RNA-seq数据，从12个工作中挖掘到154个RNA-seq数据。为了精确地鉴定所有的前向和反向剪接位点，环状病毒基因组被人为地线性化后串联起来，并将其作为参考病毒基因组，以用于后续的read mapping和比对统计。初步对HPV16 和HPV35 RNA-seq数据筛选back-splice reads，其中HPV16来源的circRNAs表达丰度高，而且主要back-splice reads是包含E1^E4,E1,E6,E7基因的。经生信分析这种back-splice reads可以产生长度为472nt circRNA（HPV16 circE7），其包含完整的E7 ORF，由此作者将研究目标聚焦在HPV16 circE7。RT-PCR和northern blotting证明在已知感染HPV16的细胞株中发现HPV16 circE7的存在，HPV16 circE7耐受RNase R降解作用。
鉴定HPV circRNAs的方法【1】
虽然HPV16和 HPV35 circE7s被预测均包含miRNA结合位点，但是这些结合位点序列在两种亚型之间是不保守的，故排除了circE7海绵miRNAs发挥功能的可能性。为探讨circE7是否通过翻译蛋白发挥功能，作者构建HPV16 circE7过表达载体(circE7)，并在其基础上突变3个潜在的启动子(circE7_noATG)，和在E7 ORFs的C端附加FLAG标签。过表达circE7和circE7_Flag可明显促进circE7的表达和E7蛋白的表达（HPV16 E7特异抗体和FLAG抗体检测）。为验证到底是环状还是线性E7 RNAs促进E7蛋白的翻译，作者设计了针对环状、线性E7 RNAs和两者共同E7 ORF区域序列的siRNAs，只有沉默circE7和两者共同区域序列的siRNAs可明显抑制E7蛋白的表达，提示circE7对于E7 蛋白的表达的重要性。正如之前研究报道，热激反应可明显上调circE7翻译E7蛋白的水平。在circE7过表达载体上同时突变上游SD和下游SA剪切位点，可明显抑制circE7的表达，同时也抑制了E7蛋白的表达。
circE7 的形成和翻译【1】
胞核胞浆成分分离分析显示，HPV16 circE7主要定位在胞浆，而线性E7 mRNA主要定位在胞核。据报道，CircRNAs不依赖于cap介导的翻译需要UTR区域的m6A甲基化修饰。生信分析，发现HPV16 circE7具有多个潜在的m6A修饰位点（DRACH）。m6A的RIP实验证明circE7存在一定水平的m6A修饰。沉默著名的m6A RNA甲基化修饰酶—METTL3/14表达，可明显抑制m6A抗体 RIP后circE7的表达。突变circE7 UTR区域的潜在m6A motifs，也可明显抑制circE7的表达和同时抑制E7蛋白的表达，而不抑制线性E6/E7 mRNA的表达，提示m6A修饰对于circE7表达的重要性。多聚核糖体分馏实验证明circE7都存在不同馏分的核糖体中，而携带突变启动子的circE7_noATG在不同馏分的核糖体中表达明显降低，提示circE7与多聚核糖体存在相互联系。
circE7的分子特性【1】
体外实验：为了进一步研究病毒circRNAs和其编码蛋白发挥的作用，利用多四环素dox介导的慢病毒shRNA可明显敲低CaSki宫颈癌细胞中circE7表达和E7蛋白的表达水平（而不影响E6蛋白的表达），导致CaSki细胞的增殖受抑制。为排除敲低circE7表达通过脱靶效应抑制细胞增殖的可能性，作者设计了抵抗shRNA敲低效应的circResist_WT载体，虽然circResist_WT和circResist_noATG（启动子发生突变）都可恢复circE7的表达，但是只有过表达circResist_WT才可恢复并增强E7致癌蛋白的表达，并恢复CaSki细胞的增殖能力，说明敲低circE7表达是特异性抑制circE7表达，进而抑制细胞增殖。
circE7编码蛋白有助于CaSki细胞生长【1】
体内实验：通过在裸鼠上移植dox诱导circE7表达沉默的CaSki细胞后，发现敲低circE7表达可抑制肿瘤生长，表现为更小而边界清楚，核浆比例减小，组织侵袭程度降低，Ki-67表达阳性减少，同时组织中HPV16 E7致癌蛋白表达水平明显降低。
相比于CaSki细胞，含低水平HPV16病毒的HPV BP细胞中circE7的表达水平也相对较低，提示circE7的表达水平与HPV寿命相关。经HPV31感染后的人包皮角质HFK和宫颈癌上皮内瘤变来源的细胞中均可检测到circE7的表达，但这些细胞经分化后circE7的表达水平明显降低，提示circE7的表达水平受角质细胞的分化调控。
circE7 在肿瘤中发挥的生理功能【1】
小结：之前的研究倾向于circRNA发挥作为miRNA海绵，调控下游基因表达的作用，现在circRNA研究热点貌似越来越倾向其他罕见或者未被挖掘的功能（如编码蛋白发挥功能），这篇研究发现HPV感染的组织中筛选出circE7，敲低circE7表达，抑制了其编码蛋白E7的表达，抑制肿瘤细胞的增殖和生长。但circE7和E7蛋白具体通过调控宿主细胞的哪个靶基因发挥功能，及其在HPV感染、潜伏和促进肿瘤发生过程中扮演的角色的问题，还是有待研究的。circE7的稳定性和其编码蛋白E7的致癌作用，提供了其可作为诊断高风险性HPV感染的标志物的依据。
参考文献
1. Jiawei Zhao, Eunice E. Lee, Jiwoong Kim，et al. Transforming activity of an oncoprotein-encoding circular RNA from human papillomavirus. Nature Communications. https://doi.org/10.1038/s41467-019-10246-5