环形RNA (circular RNAs, circRNAs) 在很长一段时间内被认为是非编码RNA，但近两年有越来越多的证据表明其可以翻译，目前环形RNA翻译蛋白质（多肽）也成了最热门的研究方向之一。大强今天会根据已发表的相关文章归纳一个基础的研究思路和策略，以供大家参考。
鉴定验证环形RNA可以翻译，主要考虑大规模鉴定、序列翻译能力、内源蛋白检测、翻译的调控和功能研究几个方面。
大规模鉴定
翻译（蛋白质合成）主要是在核糖体中进行的，且正在翻译的RNA分子倾向于结合多个核糖体单体（多聚体，polysomes），因此想办法固定核糖体和RNA后，从细胞裂解液里分离核糖体组分，再对其携带的RNA进行分析，就有可能批量化发现可以翻译或正在翻译的RNA。
实验中可以使用放线菌酮（Cycloheximide）或三尖杉酯碱（Harringtonine）抑制翻译进行，之后裂解细胞，然后以蔗糖密度梯度离心分离不同组分（polysome profiling），接着从polysomes组分中分离RNA。或者以30%的蔗糖溶液进行离心分离RNC沉淀（full-length translating mRNA profiling），接着从RNA沉淀中分离RNA。再对分离的RNA进行高通量测序分析，测序之前进行RNase R消化以富集环形RNA是一个可选项。另外可以分离核糖体后先使用低浓度的RNase T1进行消化（ribosome profiling），然后分离核糖体单体亚基之间被保护的RNA片段（ribosome footprints, RFPs）。再对这些RNA片段进行高通量测序，从测序reads中搜索符合环形RNA的backspliced junction。
另外有文章报道甲基化修饰m6A可以促进环形RNA翻译，因此可以提取total RNA后使用m6A抗体做IP，富集含m6A的RNA，之后进行高通量测序分析。
序列翻译能力
分析具体的环形RNA是否翻译，可以利用现有的算法工具或软件分析是否有合适的ORF，为排除假阳性或与线性RNA的同源干扰，可以只关注ORF跨越backspliced junction的环形RNA。接着分析对应的氨基酸序列特征以及翻译的可能性。然后分析RNA和氨基酸序列在多物种中的保守性。
分析后需要实验证据证明待定的环形RNA可以翻译，因此需要构建环形RNA的过表达载体，以及添加标签（如3xFlag）、删除ATG、删除下游IR和对应ORF线性翻译的阳性对照载体等。翻译验证可以先使用RRL等体外翻译系统，再转染细胞或使用AAV注射小鼠后进行检测，初步证明预测的环形RNA及ORF可以翻译。
接下来分析验证环形RNA和核糖体的结合，可以使用蔗糖密度梯度离心分离不同的核糖体组分，然后以RT-PCR检测组分中的环形RNA。
最后还要分析序列翻译的起始机制，最常见的是考虑IRES介导，可以使用现有的工具（如circBank、circRNADb数据库）预测序列中的IRES活性片段，再构建报告载体验证IRES活性。也有考虑m6A介导的翻译，可以预测m6A位点，并构建野生型和位点突变型载体进行验证。
内源蛋白检测
初步确认环形RNA可以翻译后，还需要在细胞系或动物体中检测到内源的蛋白质（多肽）。可以定制并验证高特异性的抗体，然后进行免疫组化和Western blot检测。有需要时可以增加过表达和siRNA等分组，注意应同步检测对应的环形RNA。
之后可以使用定制的特异性抗体进行IP，富集目的条带后进行质谱检测（液相-二级质谱串联，LC-MS/MS），以验证确认相应的肽段（氨基酸序列）。
另外可以补充验证环形RNA或环形RNA翻译的蛋白质与翻译起始因子的互作，如与IRES介导对应的eIF4G或ITAF，以及与m6A介导对应的YTHDF1/2/3等。
翻译的调控
以IRES或m6A介导的环形RNA翻译都是cap-independent translation，因此也有必要验证特定的刺激或蛋白可以调控这种翻译。例如热应激或饥饿处理，以及eIF4E、4E-BP、FOXO、FTO、METTL3/14等。
功能研究
功能研究的策略和套路很多，就不赘述了，需要注意很多时候RNA和对应蛋白质的丰度并不一致或不呈现一致的变化趋势，因此功能研究可能需要区分可翻译的环形RNA以及其翻译的蛋白质。
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